Конститутивная гетерологичная экспрессия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3 в трансгенных растениях табака

• Автор: Ильясова, Альбина Абузаровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 148 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Принципы генетической регуляции роста и развития растений

1.1.1. Регуляция экспрессии генов

1.1.2. Методы изучения генетической регуляции развития

1.2. Рост и развитие растений

1.2.1. Типы генов-регуляторов морфогенеза

1.2.2. Морфогенез листа

1.2.3. Морфогенез цветка

1.2.4. Транскрипционные факторы, участвующие в регуляции роста и развития
1.2.5. Эпигенетическая регуляция роста и развития растений
1.2.6. Участие малых РНК в регуляции развития растений
1.3. Исследуемые гены: ARGOS, AINTEGUMENTA и CLA VATA3
1.3.1. ARGOS
1.3.2. AINTEGUMENTA
1.3.3. CLA VATA3
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Краткая характеристика объектов исследования
2.2. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2.3. Выделение и очистка тотальной ДНК растений
2.4. Выделение тотальной РНК растений тризолом и построение первой цепи кДНК
2.5. Выделение тотального белка из растений и флюориметрическое определение активности гена GUS в клеточных экстрактах
2.6. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.7. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами и реакция лигирования
2.8. Аналитический гель-электрофорез ДНК
2.9. Препаративный гель-электрофорез ДНК и элюция ДНК из агарозных гелей
2.10. Полимеразная цепная реакция
2.11. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным
методом
2.12. Подготовка компетентных клеток E
2.13. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК
2.14. Подготовка электрокомпетентных клеток A. tumefaciens
2.15. Электропорация компетентных клеток A. tumefaciens
2.16. Агробактериальная трансформация листовых дисков табака
2.16.1. Стерилизация листьев, подготовка эксплантов и наращивание культуры агробактерий

2.16.2. Инокуляция и совместное культивирование

2.16.3. Промывка эксплантов и начало селекции
2.17. Стерилизация семян трансгенных растений табака и рассев на селективной среде
2.18. Морфологическая характеристика трансгенных растений и условия их выращивания
2.19. Определение концентрации цитокининов, ИУК и АБК
2.20. Реактивы и материалы
2.21. Составы использованных стандартных растворов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Конструирование гибридных промоторов каулимовирусов молекулярно-биологическими методами и анализ их экспрессионной активности в трансгенных растениях табака
3.2. Конститутивная экспрессия гена ARGO'S под контролем промотора вируса мозаики георгина
3.2.1. Поиск гомологов гена ARGOS A. thaliana в GenBank и сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков
3.2.2. Получение генно-инженерной конструкции гена ARGOS с промотором вируса мозаики георгина и сайтом polyA вируса мозаики цветной капусты в векторе pCambia 2301
3.2.3. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген ARGOS A. thaliana и их морфологический анализ
3.3. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген A1NTEGUMENTA рапса под контролем промотора вируса мозаики
георгина
3.3.1. Амплификация гена ANTрапса и получение генно-инженерных конструкций целевого гена в векторах pCambia 2201 и 2301

кратковременному воздействию низких температур (Лутова, 2005). Тем не менее, формирование меристемы цветка всё же находится под жестким контролем генотипа и в меньшей степени определяется условиями окружающей среды.
Активация главного переключателя, Заставляющего АМП производить зачатки цветков вместо листьев или стеблей, происходит за Счёт генов FLORJCAULA (FLO) в львином зеве (Coen et al., 1990), LEAFY (LFY) в арабидопсисе (Weigel et al., 1992), FALSI FLORA в томате (Molinero-Rosales et al., 1999) или ABERRANT LEAF NON FLOWER в петунии (Souer et al., 1998).
Переход к цветению у арабидопсиса зависит от уровня экспрессии гена . LFY. При мутации Ify возникает соцветие с многочисленными зелеными листьями, при этом цветки также имеют множество вегетативных признаков. Выяснено, .что при нормальном развитии экспрессия гена LFY наблюдается только у молодых растений и постепенно усиливается. По достижении определенного уровня экспрессии меристема переходит к инициации соцветия. Следует отметить, что продукт гена LEAFY оказался транскрипционным фактором, содержащим MADS-бокс. Ген LFY считается геном, кодирующим особенности флоральной меристемы, его гомологи найдены у многих растений. Имеются данные о том, что у львиного зева при мутации в гомологичном гене FLO цветки вообще не образуются (Чуб, 2005).
Транскрипционный фактор LFY может сам перемещаться в толще АМП, так' как он был обнаружен в клетках, в которых ген LFY не экспрессировался (Haecker, Laux, 2001). Также выяснено, что повышенная экспрессия LFY или его ортологов в АМП является причиной ускорения цветения во многих системах, таких как арабидопсис, тополь (Weigel. Nilsson, 1995) или апельсиновое дерево (Pena et al., 2001), но не является причиной 'развития эктопических флоральных тканей снаружи от зачатков цветка. Предположительно, архитектура цветка в значительной степени, но не полностью, контролируется переключателем FLO/LFY. Действительно, в