Разработка мультиплексной ПЦР в реальном времени для детекции возбудителей ОРВИ человека

• Автор: Сергеева, Елена Игоревна
• Шифр специальности: 03.01.03, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 177 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список принятых сокращений

Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы: Методы дифференциальной диагностики вирусов, вызывающих ОРВИ у человека

1.1. Вирусы гриппа

1.2. Вирусы парагриппа человека

1.3. Респираторно-синцитиальный вирус человека

1.4. Метапневмовирус человека

1.5. Риновирусы

1.6. Коронавирусы человека

1.7. Аденовирусы человека

1.8. Бокавирус человека
Заключение по обзору литературы
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Химические реактивы, ферменты и наборы
2.2. Буферные растворы и питательные среды
2.3. Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды
2.4. Трансформация компетентных клеток E. coli
2.5. Выделение плазмидной ДНК
2.6. Создание музея трансформированных штаммов E. coli
2.7. Использованные в работе штаммы вирусов
2.8. Получение препаратов вирусов
2.9. Определение физического титра вируса
2.10. Клинический материал
2.11. Подготовка проб, выделение вирусной РНК/ДНК, реакция обратной транскрипции
2.12. Полимеразная цепная реакция
2.13. Исследование чувствительности ПЦР
2.14. Электрофоретический анализ и выделение продуктов ПЦР из геля
2.15. Определение нуклеотидных последовательностей
2.16. Анализ нуклеотидных последовательностей
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1. Разработка мультиплексной ПЦР в реальном времени для детекции возбудителей ОРВИ человека
3.1.1. Дизайн праймеров и флуоресцентных зондов
3.1.2. Разработка и апробация контролей ПЦР в реальном времени
3.1.3. Оптимизация ПЦР в реальном времени
3.1.4. Оценка чувствительности и специфичности ПЦР в реальном времени
3.1.5. Сравнение разработанного метода с аналогом
3.2. Исследование структуры возбудителей ОРВИ, обнаруженных в клинических образцах от жителей г. Новосибирска в 2011-2012 гг.

3.2.1. Изучение видового разнообразия возбудителей ОРВИ
3.2.2. Изучение видового разнообразия возбудителей ОРВИ в разных возрастных группах
3.3. Исследование генетического разнообразия обнаруженных вирусов
Выводы
Список публикаций по теме диссертации
Список использованной литературы
Приложение 1. Схема постановки ПЦР-РВ для детекции 20 видов и 5 субтипов возбудителей ОРВИ человека
Приложение 2. Схема проведения анализа для детекции 20 видов и 5 субтипов возбудителей ОРВИ человека
Приложение 3. Патент РФ №2473702
Приложение 4. Инструкция по приминению набора реагентов «Вектор-ПЦРрв-Парагрипп 1-4»
Приложение 5. ТУ № 9398-037-056-64-012-2013 на набор реагентов «Вектор-ПЦРрВ-Парагрипп 1-4»
Приложение 6. Лабораторный регламент № 05664012-016-13 на производство набора реагнетов «Вектор-ПЦРрв-Парагрипп 1-4»

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция ПЦР - полимеразная цепная рекция
ЦНИИЭ - центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии
ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени
ОРЗ - острое респираторное заболевание
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
кДНК - комплементарная ДНК
н. - нуклеотид
РГА - реакция гемагглютинации
РТГА - реакция торможения гемагглютинации
ЦПД - цитопатическое действие
ПИФ - метод прямой иммунофлуоресценции
ТЦПД50/мл - 50%-я тканевая цитопатическая доза
ОТ-ПЦР - обратно-транскриптазная ПЦР
ИФА - иммуноферментный анализ
NASBA - реакция транскрипционной амплификации
ОТ-ПЦР-РВ - обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция в реальном времени
CDC - Center for Disease Control and Prevention (Центр по контролю и предотвращению заболеваний)
FDA - Food and Drug Administration (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (США))
LAMP - изотермальная петлевая амплификация ПГ - вирус парагриппа человека ГЭ - геномный эквивалент
РСВ - респираторно-синцитиальный вирус человека
RSV - human respiratory syncytial virus (респираторно-синцитиальный вирус человека)
Формат анализа Ген-мишень Чувст., % Спец., % Описание Ссылка
Мультиплексная ОТ-ПЦР N 96,0 98,8 Детектирует 19 агентов ОРВИ человека. Предел чувствительности составил 0,1 ЦПД50/МЛ. Более чувствителен, чем, чем сочетание методов заражения культуры клеток и ПИФ. Krunic N. et aL 2
Мультиплексная ОТ-ПЦР Интеллектуальная собственность 80 99,7 ResPlex 11 детектирует 12 агентов ОРВИ человека. Более чувствителен, чем методы заражения культуры клеток и ПЦР с использованием TaqMan-зондов. Исследовано 360 образцов, из них 13 - положительные. Li H. et al„ 2
Мультиплексная ОТ-ПЦР Интеллектуальная собственность MultiCode-PLx: суспензионный ДНК-биочип (Luminex хМАР), идентифицирует 17 вирусов. По чувствительности выше методов ПИФ и заражения культуры клеток. Исследовано 354 образца, из них 9 - положительные. Nolte F.S. et al., 2
ОТ-ПЦР-РВ Б 100 Предел чувствительности 56-76 копий/реакция. Исследовано 778 клинических образцов. Pabbarajua K. et al., 2
ОТ-ПЦР-РВ Интеллектуальная собственность 70,6 95,5 Более чувствителен, чем ИФА. Исследовано 247 образцов, полученных от детей. Kikuta H. et al., 2
ОТ-ПЦР-РВ N Более чувствителен, чем метод ПИФ. Исследован 221 образец. Hopkins M.J. et al., 2
Количественная ОТ-ПЦР-РВ N Предел чувствительности составляет 1,1x10 копий/реакция. Диагностические характеристики не оценивались. Bharaj P. et al., 2
Мультиплексная ОТ-ПЦР-РВ И нтеллектуальная собственность - Метод позволяет детектировать 12 вирусов. Предел чувствительности 10 копий/реакция. Исследован 91 образец. Wang W. et al., 2
Мультиплексная ОТ-ПЦР-РВ Р Seeplex: (Seegene Inc., Южная Корея) детектирует 12 вирусов. Предел чувствительности 10-100 копий/реакция. Более чувствителен, чем метод заражения культуры клеток. Исследован 101 образец. Kim S.R. etal., 2
Мультиплексная ОТ-ПЦР Р Выявляет 13 вирусов. Использована технология FRET-зондов. Предел чувствительности 2,5-25 копий/реакция (2.5 х Ю3-2.5 * 104 копий/мл). Чувствительность метода превосходит ИФА. Lassaunierc R. ct al
Мультиплексная ОТ-ПЦР Р Метод позволяет детектировать 16 вирусов и 2 бактерии. Использована технология ДНК-биочипа. Диагностические характеристики не изучены. Cannon G.A. etal., 2
Мультиплексная ОТ-ПЦР-РВ 1 - Идентифицирует 9 вирусов. Более чувствителен, чем метод ПИФ. Диагностические характеристики не определены. Чувствительность метода превышает чувствительность ПИФ. Auburn H. et al., 2
Мультиплексная ОТ-ПЦР-РВ Р Идентифицирует 14 вирусов. Более чувствителен, чем референс-ПЦР. Jansen R.R. et al., 2
Мультиплексная ОТ-ПЦР-РВ И нтеллектуал ьная собственность 90 100 1NFINITI RVP-Plus: детектирует 25 вирусов. Более чувствителен, чем референс-ПЦР. Al-Turab M. et al., 2
Мультиплексная ОТ-ПЦР-РВ Интеллектуальная собственность 99,5 83,7 Детектирует 18 вирусов. Более чувствителен, чем метод заражения культуры клеток и детекции антигена. Исследовано 834 образца. Clioudliary M.L. er al, 2