Исследование трансфекции клеток наночастицами полиплексов на основе полиэтиленимина

• Автор: Уласов, Алексей Валентинович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
Список сокращений
Введение
Обзор литературы
Полимеры, используемые для доставки генетической информации
Проникновение полиплексов в клетку
Оптимизация полиплексов при локальном и системном введении
Терапевтические стратегии использования полиплексов
Постановка цели и задач работы
Материалы и методы
Результаты
Обсуждение
Выводы
Благодарности
Приложение
Список литературы

Список сокращений
ос-МСГ - а-меланоцит-стимулирующий гормон
CAGGS - промотор, включающий в себя IE-энхансер цитомегаловируса, промотор гена
Р-актина цыпленка и сигнал полиаденилирования гена р-глобина кролика
CMV - цитомегаловирусный промотор
EGF - эпидермальный фактор роста
EGFP - усиленный зеленый флуоресцентный белок
FRET - безызлучательный резонансный перенос энергии по Фёрстеру
hTert - теломеразный промотор человека
HSVÆ - тимидинкиназа вируса простого герпеса первого типа
N/P - молярное соотношение азотов ГГЭИ к фосфатам ДНК
NLS - сигнал ядерной локализации
NPC - комплекс ядерной поры
РАМАМ - полиамидоамины
РНРМА - поли-(2М-гидроксилпропилметакриламид)
PLL - полилизин
РРА - полифосфорамидат
Surv - сурвивиновый промотор человека
RLU/мг белка - активность люциферазы, отн. свет. ед. / мг белка
ТАТ - пептид, фрагмент ТАТ-белка ВИЧ-1, придающий комплексу, в состав которого он входит, способность проникать в клетки ТЕ - эффективность трансфекции WGA — лектин из проростков пшеницы кД - килодальтон
МК1С - пептид, имеющий в своем составе последовательность, связывающуюся с
меланокортиновыми рецепторами первого, и минимальную последовательность NLS
большого Т-антигена вируса SV-
ПЭГ - полиэтиленгликоль
ПЭИ - полиэтиленимин
т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

Введение
Генотерапия представляет собой совокупность методов, направленных на внесение генетической информации в клетки с целью лечения как наследственных, так и приобретенных заболеваний. Данная технология основана на корректировании механизмов заболеваний и/или их причин с помощью доставки и последующей экспрессии экзогенных молекул ДНК, кодирующих отсутствующие или поврежденные продукты генов. В 1990 г. генотерапевтический подход (доставка' гена аденозивдезаминазы в Т-клетки) впервые был использован в клинике при лечении 4-летней девочки, страдающей тяжелым комбинированным иммунодефицитом. С тех пор данная технология была существенно развита, и многочисленные клинические испытания были проведены и проводятся. Клинические испытания проводятся на различных видах опухолей, сердечнососудистых, инфекционных, наследственных заболеваниях (Gaspar et al., 2004; Bainbridge et al., 2008). Ключевым моментом генотерапии являются методы доставки генетической информации в клетки-мишени.
Сз'ществующие системы доставки генетической информации подразделяются на 2 группы: вирусные и невирусные векторы. Первыми начали использовать в качестве векторов вирусы (в начале ретровирусы (Rosenberg et al., 1990) затем аденовирусы, адено-ассоциированые вирусы и ряд других) по причине высокой трансфекции клеток-мишеней и, как следствие, высокой эффективности применения данного способа доставки. Однако, несмотря на это преимущество, вирусные векторы отличаются высокой иммуногенностыо, возможностью реверсии к дикому типу в результате рекомбинации или мутаций. Некоторые вирусы (ретровирусы), используемые в качестве векторов, способны встраиваться в ДНК клетки-хозяина, что может приводить к образованию опухолей, посредством активации онкогенов. В числе других ограничений для применения вирусных векторов можно назвать малую емкость переносимого генетического материала для ряда вирусов и свойственную некоторым вирусам клеточную специфичность. Из-за этих недостатков практическое применение вирусных векторов на людях далеко не безопасно, что подтверждается смертью пациента при использовании аденовирусного вектора (Raper et al., 2003), развитием лейкемии при ретровирусной генной терапии (Howe et al., 2008), индуцированной адено-ассоциированным вектором аутоиммунной реакцией (Мапио et al., 2006).
В качестве альтернативы вирусным векторам используются невирусные системы доставки: липоеомы, катионные липиды, катионные полимеры, различные конъюгаты на их основе, а также методы электропорации и бомбардировка частицами (gene gun) (Ogris, 2006). Несмотря на то, что физические методы трансфекции (электропорация и gene gun)
отношений конъюгат/плазмида N/P концентрацию ДНК в полиплексе сохраняли равной 20 мкг/мл, в то время как варьировали концентрацию блок-сополимера в полиплексе для получения соотношений N/P от 10 до 40.
Определение цитотоксичности полиплексов
Для оценки цитотоксичности полиплексов клетки рассаживали на по 2 тысячи клеток в лунку в 96-луночные плашки в соответствующей среде с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Через сутки среда была заменена на свежую и клетки трансфицировали. В качестве контроля использовали нетрацсфицированные клетки. Через 3 суток выращивания в ССД-инкубаторе при 37°С выживаемость определяли при помощи МТТ-теста (Fischer et al., 2003).
Распаковка полиплексов гепарином
Для сравнения стабильности ДНКк распаковке в полиплексе на основе ПЭИ или ПЭИ-ПЕГ-ТАТ использовался гепарин (Синтез, Россия). К 50 мкл полиплекса добавлялось по 5 мкл раствора гепарина до конечной концентрации 0,2 — 0,5 МЕ (международных единиц) в 50 мкл. После интенсивного перемешивания на вортексе инкубировали в течение 10 минут. Затем к 20 мкл раствора добавляли 2 мкл 10х краски для нанесения и наносили на 0,6% агарозный гель. Далее разгоняли на электрофорезе в течение 30 минут при 60 В. Полученный гель фотографировали с помощью фотосистемы Kodak ED AS 290.
Определение устойчивости ДНК полиплексов к ферментативной деградации
В эксперименте исследовали полиплексы на основе ПЭИ-ПЭГ-TAT и на основе немодифицированного ПЭИ с разным соотношением N/P (10; 20; 30; 40). В качестве модели ферментативной деградации использовали ДНКазу I (Силекс, Россия). К 39,5 мкл полиплекса добавлялся 1 мкл ЗМЕ/мкл ДНКазы I и 4,5 мкл десятикратного буфера для ДНКазы. После интенсивного перемешивания раствор инкубировался в течение 30 минут, затем добавлялось 5 мкл терминирующего буфера (0,5М EDTA, 2М NaOH, 0,5М NaCl), чтоб остановить реакцию, и 1 мкл с 2 МЕ гепарина для полной распаковки комплекса. После 10 минут инкубации 20 мкл раствора смешанного с 2 мкл красителя для нанесения наносилось на 0,6% агарозный гель. Электрофорез производился при 60 В в течение 30 минут. Полученный гель фотографировали с помощью фотосистемы Kodak EDAS 290.