Получение и иммунологическая характеризация полноразмерных рекомбинантных белков NP, VP40 вируса Эбола и VP40, VP35 вируса Марбург

• Автор: Иванова, Алла Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 132 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Таксономия семейства Филовирусов

1.2. Морфология и структура вирионов

1.3. Организация генома, структура и функции белков филовирусов

1.3.1. Нуіслеопротеин (ЫР)

1.3.2. Основной матриксный белок (УР40)

1.3.3. Компонент полимеразного комплекса (УР35)

1.3.4. Гликопротеин (ОР)

1.3.5. Минорный компонент нуклеокапсида (УРЗО)

1.3.6. РНК-3АВИСИМАЯ РНК-ПОЛИМЕРАЗА (Ь)
1.3.7. Минорный матриксный белок (УР24)
1.4. Предполагаемый природный резервуар возбудителей филовирусной инфекции
1.5. Клинические симптомы геморрагических лихорадок
1.6. Использование рекомбинантных белков в иммунодиагностике ЗАБОЛЕВАНИЙ
1.7. Конструирование гибридных плазмид и получение рекомбинантных
БЕЛКОВ
1.8. Рекомбинантные белки как антигены для иммунодиагностики
Заключение по обзору литературы
ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
Основные методы
2.2.1. Проведение реакции обратной транскрипции
2.2.2. Очистка продуктов амплификации
2.2.3. Подготовка векторной плазмиды для получения рекомбинантных плазмид
2.2.4. Проведение реакции ДНК-лигирования
2.2.5. Приготовление компетентных клеток Е. сои
2.2.6. Трансформация компетентных клеток Е. сои гибридным и плазмидами
2.2.7. Выделение плазмидной ДНК
2.2.8. Рестрикционный анализ гибридных плазмид
2.2.9. Определение последовательности нуклеотидных остатков ДНК
2.2.10. Экспрессия рекомбинантных белков в прокариотической системе Е.соы
2.2.11. Очистка рекомбинантных белков ..:
2.2.12. Белковый электрофорез
2.2.13. Измерение концентрации белков
2.2.14. Методы очистки МКА
2.2.15. Измерение концентрации очищенных МКА
2.2.16. Приготовление конъюгатов МКА с биотином
2.2.17. ИММУНОБЛОТ
2.2.18. Твердофазный ИФА
2.2.19. ИФА В ФОРМАТЕ «СЭНДВИЧ»
ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Конструирование гибридных плазмид, несущих полноразмерные копии генов филовирусов
3.1.1. Конструирование плазмид, несущих полноразмерные копии генов УР40иИРВЭ
3.1.2. Конструирование плазмид, несущих полноразмерные копии генов УР40 и УР35 ВМ

3.2. Получение продуцентов и очистка рекомбинантных белков в ДЕНАТУРИРУЮЩИХ УСЛОВИЯХ
3.2.1. Получение и очистка рекомбинантного белка УР40 ВЭ
3.2.2. Получение и очистка рекомбинантного белка ИР ВЭ
3.2.3. Получение и очистка рекомбинантного белка УР40 ВМ
3.2.4. Получение и очистка рекомбинантного белка УР35 ВМ
3.3. Сравнительное изучение антигенных и иммуногенных свойств БЕЛКОВ ФИЛОВИРУСОВ
3.3.1. Изучение антигенных свойств рекомбинантных белков ВЭ с помощью панели МКА
3.3.2. Отбор парных МКА, не конкурирующих за антигенные эпитопы вирусных и рекомбинантных белков ИР и УР40 ВЭ
3.3.3. Отбор парных МКА, не конкурирующих за антигенные эпитопы вирусных и рекомбинантных белков УР40 и УР35 ВМ
3.3.4. Выявление вирусных и рекомбинантных белков ВЭ в ИФА формата «сэндвич» на основе двух видов МКА
3.3.5. Выявление вирусных и рекомбинантного белка УР40 и УР35 ВМ в ИФА формата «сэндвич»на основе двух видов МКА
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

рекомбинантном виде. Наиболее часто используемым хозяином для экспрессии чужеродных генов является грамотрицательная бактерия E.coli. Прокариотическая система экспрессии имеет ряд преимуществ. Бактерия довольно легко культивируется в лабораторных условиях и не требует условий повышенной стерильности, относительно безопасна для человека, имеет высокую скорость роста, наиболее детально изучена на молекулярном уровне, получено множество штаммов, обладающих различными генетическими и физиологическими свойствами, и для нее применимо большинство методик генной инженерии [85].
Но есть и минусы. Не все рекомбинантные гены экспрессируются с высокой эффективностью. При высоком уровне биосинтеза белок переходит в нерастворимое состояние, образуя тельца включения, в которых рекомбинантные белки находятся в денатурированном неактивном состоянии. Для модификации вторичной структуры белка необходимо применять мощные денатурирующие агенты, такие как мочевина, гуанидинхлорид и детергенты. В процессе обработки белки могут изменять свою структуру, а при концентрировании из разбавленных растворов, в которых проводится ренатурация, часто вновь выпадают в осадок [21].
Более универсальным подходом к получению рекомбинантных белков в растворимой форме является обеспечение секретируемого характера их экспрессии, т.е. секреции синтезирующихся рекомбинантных белков в питательную среду, что значительно облегчает их очистку, даст возможность приобрести нативную конформацию. Примером эффективного использования секреторной системы E. coli является получение швейцарскими исследователями рекомбинантного инсулино-подобного фактора роста I в секретируемой форме (IGF-I), белка среднего размера, полипептидная цепь которого содержит несколько потенциальных сайтов N-гликозилирования и в процессе фолдинга образует три дисульфидные связи [83]. В этой системе авторам удавалось нарабатывать до 1 г. рекомбинантного белка в 1 л. бактериальной культуры.