Рибосомные и кодирующие белки гены (gyrB, alkB и parE) бактерий рода Geobacillus и использование их в таксономии и экологии

• Автор: Коршунова, Алена Викторовна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Физиология, распространение и видовое разнообразие бактерий рода
ОеоЬасШиз
1.2. Биотехнологический потенциал бактерий рода ОеоЬасШиз
1.3. Молекулярно-биологические методы, используемые в таксономии
бактерий и изучении микробных сообществ
1.4. Гены ферментативной системы биодеградации и-алканов у бактерий.
1.4.1. Система окисления к-алканов у РзеиВотопаз риИс!а СРо
1.4.2. Организация а1к генов у других грамотрицательных бактерий -
деструкторов н-алканов
1.4.3. Организация генов деградации н-алканов у грамположительных
бактерий
1.5. Строение и функции гиразы и топоизомеразы IV у бактерий
1.6. Заключение по обзору литературы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Состав сред и условия культивирования бактерий рода ОеоЬасШиз..
2.3. Выделение ДНК и РНК
2.4. Обратная транскрипция
2.5. Создание праймеров, специфичных к генам &гВ ирагЕ
2.6. Амплификация генов 16Б рРНК, &гВ, а1кВ ирагЕ
2.7. Клонирование и ссквснирование ПЦР-продуктов
2.8. Филогенетический анализ полученных последовательностей и
построение филогенетических деревьев
2.9. Использование ПЦР в режиме реального времени для изучения синтеза
мРНК генов а1кВ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Определение первичной структуры генов гиразы {руг В) и топоизомеразы
IV (рагЕ) у бактерий рода ОеоЬасШиз
3.2. Идентификация представителей рода СеоЬасШт на основе
сравнительного филогенетического анализа генов 16Б рРНК и генов ругВ и топоизомеразы IV и оценка возможности использования последних для таксономии геобацилл
3.3. Поиск генов ферментативной системы биодеградации н-алканов у
бактерий рода ОеоЬасШш и определение первичной структуры алкан-гидроксилаз
3.3.1. Амплификация и сравнительный филогенетический анализ генов а!кВ
геобацилл
3.3.2. Анализ нуклеотидного состава аШ?-генов и использования кодонов
3.4 Исследование гомологов алкан-монооксигеназы а1кВ у б. яиЫеггапеш

3.4.1 Локализация генов а1кВ в геноме углеводородокисляющей бактерии
ОеоЬасШш зиЬ1еггапеш штамм К
3.4.2 Детекция мРНК генов а1кВ у бактерии О. зиЫеггапеиь К при росте на н-
алканах
3.5. Филогенетическое разнообразие генов 16Э рРНК и а1кВ в библиотеках
клонов, полученных на основе ДНК и РНК из накопительных культур аэробных углеводородокисляющих бактерий из высокотемпературного нефтяного пласта
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Термофильные нефтеокисляющие бактерии рода Geobacillus являются обычными обитателями высокотемпературных нефтяных пластов (Назина, Беляев, 2004). В процессе окисления н-алканов нефти геобациллы образуют биосурфактанты, что обусловливает их большой биотехнологический потенциал для повышения нефгеизвлечения. Надежное обнаружение геобацилл в микробном сообществе нефтяного пласта позволяет принимать решение о возможности применения биотехнологий повышения нефтеизвлечения, основанных на активации нефтеокисляющих бактерий. В период после первого описания рода Geobacillus (Nazina et al., 2001) были предложены 19 новых видов, размывающих границы существующих видов и рода. В 2010— 2012 годах на основании анализа генов 16S рРНК была начата новая ревизия рода. Часть видов была перенесена в новые роды (Aeribacillus, Caldibacillus), а ряд видов был объединен (Minana-Galbis et al., 2010; Dinsdale et al., 2011; Coorevits et al., 2012). Последовательности генов 16S рРНК представителей рода Geobacillus очень близки, а у ряда видов эти гены не различаются. Таким образом, существует необходимость в поиске новых генетических маркеров или признаков, позволяющих осуществить внутривидовую и межвидовую дифференциацию геобацилл. Эти сведения необходимы также для обнаружения геобацилл в микробных сообществах и выявления их метаболической активности.
На настоящий момент показана возможность использования генов «домашнего хозяйства» gyrB ирагЕ для уточнения филогенетического положения представителей родов Pseudomonas (Izumi et al., 2007, Anuj et al., 2009), Vibrio (Luo and Hu, 2008), Paenibacillus (Wu et al., 2010) и др. на видовом уровне. Продукты генов gyrB и рагЕ, бета-субъединицы гиразы и топоизомеразы IV соответственно, принимают непосредственное участие в процессе репликации и разделения дочерних клеток. Высказано предложение об использовании генов gyrB и рагЕ для идентификации бактерий на внутри- и межвидовом уровне в качестве альтернативы метода ДНК/ДНК гибридизации (Suzuki et al., 2001, Wang et al., 2007).
Анализ генов 16S рРНК в сочетании с анализом генов дополнительных путей метаболизма является наиболее востребованным молекулярно-биологическим подходом при изучении микробных сообществ. Выбор генов в качестве дополнительного маркера во многом зависит от предполагаемого ключевого биогеохимического процесса, осуществляемого сообществом. Так, при исследовании метаногенов в сообществе микроорганизмов изучают ген метил коэнзим-М редуктазы (mrcA) (Luton et al., 2002;

Структури алкаи-монооксигеназы АІкВ у Pseudomonas putida GPol. Ключевой реакцией деградации н-алканов является гидроксилирование. Проводит реакцию фермент алкан-монооксигеназа AlkB. Основу фермента составляют 6 трансмембранных доменов в виде спиралей (на рисунке 3 представлены в виде цилиндров, № 1-6), соединенных между собой с помощью трех коротких пептидов с периплазматической стороны мембраны (на рисунке 3 обозначены в виде тонких линий между цилиндрами). Около 60-65% белка, в том числе С-концевой и N-концевой домены, локализованы в цитоплазме клетки.
периплазматическое пространство
Рисунок 3. Пространственная модель алкан-монооксигеназы штамма Pseudomonas putida GPol. а) дикий тип фермента, связывающий додекан (W55); б) мутантный белок W55S, связывающий гексадекан (van Beilen et al., 2005). ЦМ - цитоплазматическая мембрана
Алкан-монооксигеназа AlkB бактерии P. putida GPol относится к негемовым железосерным белкам (Katopodis et al., 1984). В последовательности белка обнаружено 4 консервативных области, богатых остатками гистидина: мотив А (НввЕХХНКмз); мотив В (E167HXXGHH173); мотив С (267YXEHYG275) и мотив D (L309QRHXDHHA317). Части белковой молекулы, соответствующие мотивам А и С, в третичной структуре белка локализованы на конце трансмембранных спиралей 4 и 6, закрывая таким образом поверхность цитоплазматической мембраны. В активном центре фермента находятся 2 атома железа (на рисунке 3 отмечены черными точками), которые координируются гистидиновыми остатками консервативных областей А, В, С и D (светлые точки).
Субстратная специфичность фермента определяется его третичной структурой (van Beilen et al., 2005). В ген алкан-монооксигеназы alkB штамма P. putida GPol методом