Новые пути регуляции функциональной активности лизилоксидазы человека

• Автор: Оккельман, Ирина Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 с. : ил.

Оглавление
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Лизилоксидазы - медь-зависимые аминоксидазы, выполняющие разнообразные функции в организме
1.1 .Семейство генов лизилоксидаз. Анализ аминокислотной последовательности лизилоксидаз
1.2.Каталитическая активность лизилоксидаз
1.2.1 .Структура медь-связывающего сайта лизилоксидаз. Формирование ЬТЦ-кофактора
1.2.2.Пути ингибирования лизилоксидазной активности
1.3.Тканевая специфичность изоформ лизилоксидаз млекопитающих и экспрессия лизилоксидаз на разных этапах онтогенеза
1.4. Роль лизилоксидаз в формирование структуры внеклеточного матрикса
1.5. Внутриклеточная локализация лизилоксидаз и связанная с ней функциональная активность лизилоксидаз
1.5.1 .Внутриклеточная локализация ЬОХ и ее функциональная активность
1.5.2.Внутриклеточная локализация ЬОХЬ2 и ее функциональная активность
1 .б.Роль лизилоксидаз в развитии раковых заболеваний 3
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Филогенетический анализ белков семейства лизилоксидаз
2.1.1. Филогенетический анализ лизилоксидаз беспозвоночных животных
2.1.2.Филогенетический анализ лизилоксидаз вторичноротых животных
2.2.Получение рекомбинантной лизилоксидазы в различных системах продуцентов
2.2.1 .Получение растворимой рекомбинантной лизилоксидазы в бактериальной системе
2.2.2.Получение рекомбинантной лизилоксидазы в дрожжевой системе продуцента
2.3 .Получение поликлональных антител к каталитическому домену лизилоксидазы
2.4. Контроль каталитической активности лизилоксидазы с помощью сайт-специфтески дейтерированного лизина
2.5.Исследование локализации эндогенной лизилоксидазы в различных клеточных линиях, тканях и первичной культуре фибробластов
2.6.Поиск белков интеракторов лизилоксидазы методом «молекулярного фишинга».
Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа - новая субстратная мишень лизилоксидазы
2.7.Поиск новых белковых партнеров зрелой формы лизилоксидазы человека в системе дрожжевого двугибридного скрининга
2.8.Картирование доменов реирессора транскрипции рббр, вовлеченных во взаимодействие с каталитическим доменом лизилоксидазы

2.9.Анализ локализации эндогенных р66(1 и ЬОХ в клетках млекопитающих. Исследование локализации лизилоксидазы и рббр в клетках при совместной экспрессии
2.10.Гипотеза о функциональной роли комплекса рббр/ЬОХ в клетке
2.11.Составление карты фрагмента интерактома клетки, включающее новые взаимодействия лизилоксидазы
2.12.Исследование ядерного транспортного белка ТТС4 в клетке
ГЛАВА.З. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1.Материалы
3.2.Получение плазмидных конструкций, использованных в работе
3.3.Методы исследования
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. — аминокислотный остаток
и.о. - пары оснований (нуклеотидных)
АТФ - аденозин-5’-трифосфат
АТФаза — аденозинтрифосфатаза
дНТФ - смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов
ДТТ - дитиотреитол
ИФА - иммуноферментный анализ
ИПТГ - изопропил-р-О-тиогалактопиранозид
кДНК - комплементарная ДНК (полученная обратной транскрипцией с мРНК)
СПК - сыворотка плода коровы BAPN -Р-аминопропионитрил BSA - бычий сывороточный альбумин
ВМР-1 - bone morphogenetic protein 1, протеаза участвующая в активации LOX и LOXL
BrdU — бромдезоксиуридин
DAP1 - 4’,6-диамидино-б-фенилиндол
DMEM - Dulbecco’s modified Eagle's medium, модифицированная Дульбекко среда Игла CDH1 - кадгерин Е
CHAPS - 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат
EDTA - этилендиаминтетраацетат
ЕМТ - эпителиально-мезенхимальная трансформация
GAPDH - глицеральдегидфосфатдегидрогеназа
GFP - зеленый флуоресцентный белок
HEPES - М-(14’-гидроксиэтил)пиперазинэтансульфоновая кислота
KLH - keyhole limpet hemocyanin, металлопротеин из гемолимфы моллюска Megathura
crenulata
FAK — киназа фокальной адгезии
LOPP — пропептидный домен LOX изоформы лизилоксидаз LOX - (lysyl oxidase) лизилоксидаза
L0XL1,2,3,4 - lysyl oxidase-like protein 1,2,3,4, лизилоксидаза-подобный белок 1,2,3,
LTQ - (lysine tyrosylquinone) лизин-тирозил хиноновый кофактор лизилоксидаз
MEMO - mediator of ErbB2-driven cell motility
MMP — металлопротеиназы
mLOX - зрелая форма LOX
мРНК - матричная РІЖ
случае эктопической экспрессии proLOX) приводит к снижению уровня фосфорилированной FAK по остаткам Туг397 и Туг576, что в свою очередь понижает
130cas
уровень связывания р с сайтами фокальной адгезии и, как результат, снижает миграционную активность клеток (101). На данный момент онкосупрессорную активность так называемого «ras recision» гена, выраженную в ингибировании трансформирующей активности HRAS онкогена, наблюдаемом при сверхпродукции LOX, принято связывать с функциональной активностью пропептидного домена LOX. Таким образом, LOPP нужно отчасти рассматривать как отдельный белок, выполняющий независимые от лизилоксидазы функции (102-104).
Адпмия и образование аггиновш ммфофиламвнтое

Фокальная адгезия
Активация РАК и сокращение клетки

«Д Jl ОС Протеолитическая деградация внеклеточного матрикса і і W ^ Раэбор^ комплекса —- — 1 тпщш i“r* Р +** <Р прогмм
Рис. 3. Роль 40X в управлении миграционной активностью клеток через /74К/Ягс сигнальный путь. Ферментативная активность ЬОХувеличивает жесткость внеклеточного матрикса, что приводит к кластеризации интегринов. Кластеризованные интегрины влияют на фосфорилирование КАК и запуск последующего сигнального каскада, который в итоге приводит к формированию актиновых волокон ламелоподий и филлоподий и стимулирует миграцию клеток. Параллельно, в реакции ЬОХ-катализируемого окисления неизвестного субстрата происходит выделение перекиси водорода, также стимулирующей активацию КАК/Згс сигнального пути. При протеолитической деградации внеклеточного матрикса происходит диссоциация РА К-сигнального комплекса и актиновых филаментов филоподий и ламеллоподий.
1.5.2. Внутриклеточная локализация ЬОХЬ2 и ее функциональная активность.
Для ЬОХТ2 изоформы лизилоксидаз также была показана внутриклеточная (27) и внутриядерная локализация (105), которые, вероятно, напрямую связаны с выше упомянутой ролью ЬОХЬ2 изоформы в репрессии гена кадгерина Е. Этот ген пока