Факторы, влияющие на фрагментацию и токсичность амилоидных полимеров в клетках дрожжей

• Автор: Александров, Александр Иванович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Свойства амилоидов

2. Прионы - инфекционные амилоиды

3. Прионы дрожжей

4. Приемные свойства БирЗЗ и Кпц1

5. Механизм наследования прионов дрожжей

5 I Механизм фрагментации амилоидов шапероном НКр104

5 2 Н5р40 и Нзр70 участвую! во фрагментации амилоидных полимеров

6. Поли! луз яминовые болезни
6 I Токсичность белков с удлиненными полшлутаминовычи трактами
6 2 Дрожжевая модель болезни Гентингтона
6 3 Гены-модификаторы токсичности полиглутамина для клеток дрожжей
6 4 Специфические черты дрожжевой модели болезни Гентиштона
7. Структура амилоидных фибрилл
8. Структурные различия амилоидных полимеров влияют на эффективность их фрагментации
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:
1. Штаммы дрожжей и кулы ивирование клеток
2. Конструирование плазмид
3. Приготовление дрожжевых лизатов
4. Фракционирование лизатов с помощью ультранентрифутировании
5. Электрофорез и блоттинг

6. Анализ термостабильности полимеров в присутствии вйЗ
7. Определение эффективности сквозного прочтения нонсенс-кодонов
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Изучение механизма токсичности полиглугамштовых белков для клеюк дрожжей
I 1 Влияние прионного состояния Япц1 на полимеризацию 1030 С1РР
I 2 Полимери тация белков 5ир35 и Г<пр 1 в присутствии ЮЗО-СРР
1 3 Роль белков Бир35 и 8ир45 в токсичности ЮЗО-ОбР
2. Влияние вставок различных аминокислотных остатков в последовательность ро!уО на образование ами.юи тных полимеров и их фра1 ментацито
2 I Генетические конструкции, кодирующие белки ро1уОХ
2 2 Влияние вставок аминокислотных остатков на возникновение амилоидных полимеров
2 3 Влияние вставок аминокислотных остатков на размер амилоидных полимеров
2 4 Эффективная фрагментация полимеров 76<ЭУ, 960У и 81(}р приводит к образованию ЭРЗ-устойчивых олигомеров вплоть до димеров
3. Термостабильность амилоидных полимеров не всегда коррелирует с их размером
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Особенности структуры полимеров ро1у(}Х белков
2. Влияние различных аминокислотных остатков в составе полит лутаминовой последовательности на
образование амилоидных полимеров и их фрагментацию
3. Факторы, влияющие на фра1 ментацию амилоидных полимеров
4. Родь фрагментации в патогенезе амилоидных болезней млекопитающих
5. Образование макроагрегатов и 51)3-усгойчнкы полимеров генгиш тина
6. Токсичность агрегированных форм гентипгтипа
7. Механизм токсического эффекта гентингтина в клетках дрожжей
8. Происхождение прионов дрожжей
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1. Математическое обоснование коррелиции между размером полимеров и эффек1ивностыо фрагментации
Приложение 2. Анализ гермосгабильносги полимеров 7Н2А с помощью БОП-АСЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:
1. Штаммы дрожжей и культивирование клеток
Белки polyQX продуцировали в клетках штамма дрожжей S. cerevisiae 74-D694/AS35 [Я/Аг], который был получен из 74-D694 (МАТа urci3-52 Ieu2-3,IJ2 Up 1-289 his3-A2Ü0 adel-14) [PIN' путем разрушения хромосомного гена SUP35 вставкой гена TRP1. Жизнеспособность штамма обеспечивалась одной из центромерных плазмид pRS315-Sup35C или pRS313-Sup35C [Alexandrov et al., 2008], которые кодируют С-домен Sup35 (сокращенно Sup35C). Для культивирования клеток использовали среды YPD (1% дрожжевой экстракт (Oxoid), 2% пептон (Sigma), 2% глюкоза), или SC (0.67% yeast nitrogen base, 2% глюкоза, а также необходимые аминокислоты). Твердые среды также содержали 2% агара (Рапгеас). Дрожжи выращивали при 30“С. Влияние делений в прионном домене Sup35 на размер и термостабильность полимеров исследовали в клетках штамма 22V-H63AS (MAT a cide2-l SUQ5 karl lysl his3 игаЗ Ieu2 cyhR sup35 : : TRPI) pRS316-Sup35. Как и у штамма 74-D694/AS35, хромосомный ген SUP35 этого штамма также разрушен вставкой TRPL Жизнеспособность 22V-H63AS поддерживалась за счет плазмиды pRS316-Sup35, которая кодирует белок Sup35 дикого типа. Для изучения влияния делений прионного домена Sup35 на размер и свойства прионных полимеров этого белка эту плазмиду заменяли плазмидой, кодирующей версии белка Sup35 с укороченным прионным доменом.
Для изучения токсичности модельного гентингтина (103Q-GFP) использовали варианты штамма 74-D694 psi3][РШ¥] и psf][pin], а также 74-D694/AS35 [PIRT]. Для индукции синтеза белков 103Q-GFP и 25Q-GFP, культуры соответствующих клеток переносили в жидкую селективную среду, содержавшую в качестве единственного источника углерода 2% раффинозу, где их инкубировали до достижения средней логарифмической фазы. Далее культуры переносили в среду с галактозой (2%) и