Высокотехнологичные методы определения метилирования ДНК

• Автор: Пехов, Василий Михайлович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1-1. Метилирование ДНК у бактерий

1-1-1. Общие сведения о метилировании ДНК у бактерий

1-1-2'. Особенности метилирования ДНК Helicobacter pylon.

1-2. Метилирование ДНК у эукариот

1-2-1. ДНК-метилтрансферазы

1-2-2. CpG-островки

1-2-3. Изменения в метилировании генома млекопитающих в

онтогенезе и при раке
1-2-41 Геномный)Импринтинг
1-2-5. Дозовая компенсация Х-хромосом
1-2-6. Еистоновые модификации
Т-2-7. Картина метилирования генома
1-2-8. Метил-ДНК связывающие белки
1-3. Методы определения метилирования ДНК
1-3-1.Методы, основанные на бисульфитной конвертация ДНК
Применение геномного секвенирования для анализа
метилирования ДНК
Применение микроматриц для анализа метилирования ДНК
1-3-2. Методы, основанные на расщеплении ДНК эндонуклеазами рестрикции, обладающими различной чувствительностью к
метилированным последовательностям
1-3-3. Использование белков, которые специфически связываются с метилированной ДНК
2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2-1. Общие молекулярно-биологические методы
2-1 -1.Олигонуклеотиды
2-1-2. Получение генетических конструкций
2-1-3. Клонирование ПЦР-продуктов

2-1-4. Получение компетентных клеток
2-1-5.Трансформация E.coli и выделение плазмидной ДНК
2-1-6. Выделение геномной ДНК из культур клеток
2-1-7. Капиллярное секвснирование ДНК
2-1-8. Экспрессия белков и наработка аффинных сорбентов
2-1-9. Получение коротких фрагментов ДНК
2-1-10. Связывание ДНК сорбентами и, гибридизация ДНК при
тестировании свойств сорбентов
2-1-11*. Количественная ПЦР в реальном времени
2-2. Геномное секвенирование
2-2-1.Связывание ДНК сорбентами Каизо и MBD2 при приготовлении. фракций ДНК для
секвенирования;
2-2-2.Приготовление геномных библиотек для секвенирования
2-2-3. Обработка данных, полученных в результате декодирования на приборе Genome Analyzer (IIlumina,CIIIA)
з: РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3-1. Создание аффинных сорбентов, применяемых для определения метилирования ДНК
3-1-1. Создание конструкций, экспрессия и очистка белков
3-1-2. Связывание аффинными сорбентами коротких
метилированных и неметилированных фрагментов ДНК
3-1-3. Связывание сорбентами геномной ДНК
3-2. Поиск метилированных районов генома клеточной линии

3-3. Применение сорбента Каизо для поиска CpG-метилированых
участков генома Helicobacter pylori
ВЫВОДЫ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ:
ДДСН - додецилсульфат натрия
ДМР - дифференциально-метилированные районы
КСС - Каизо Связывающий Сайт
мкл - микролитр
МТ - метилтрансфераза
об/мин - оборотов в минуту
ОРС - открытая рамка считывания
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЦР - полимеразная цепная реакция
Р-М - рестрикция - модификация
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭСК - эмбриональные стволовые клетки
АТР - Аденозинтрифосфорная кислота (Adenosine triphosphate)
CpG - CpG-динуклеотид
BTB/POZ - семейство белков содержащих на N-конце ВТВ домен и на С-конце домен «цинковые пальцы» (Broad complex, Tramtrak, Brie a brac/POx virus, and Zinc finger)
CCD - прибор с зарядовой связью (Charge-Coupled Device)
ChlP-Seq - хроматиновая иммунопреципитация с последующим секвенированием
CGBP - CpG - связывающий белок (CpG binding protein)
Dnmt - ДНК-метилтрансфераза DTT - дитиотрейтол
GST - Глутатион-8-трансфераза (Glutathione-S-transferase)
ICE - элемент, контролирующий импринтинг (imprinting control element)
IPTG - Изопропил-|3-0-1-тиогалактопиранозид
LM-PCR - ПЦР, обусловленная лигированием (ligation-mediated PCR)
LB - среда Лурия-Бертани (Luria-Bertani)

Метилирование в хромосомах.
Участки гиперметилирования в геноме тесно связаны с
гетерохроматином. Так, в геноме ЛгаЫйорх'м (каПапа обширные районы
ДНК-метилирования затрагивают гетерохроматиновые участки всех
хромосом, включая центромеры, околоцентромерные участки и
гетерохроматиновый кноб (узел) на 4 хромосоме. Такой профиль
метилирования отражает распределение транспозонов и других повторов в
геноме (38). По данным других авторов, 91% транспозонов, 58%
псевдогенов, 20% экспрессирующихся генов АгаЫс1ори1я (каПапа
метилированы (87). В растениях, несущих мутацию с потерей функции в гене
поддерживающей метилтрансферазы МЕТ1, происходит резкое повышение
уровня экспрессии транспозонов (38,87).
Метилирование внутри гена.
Согласно общепринятой точке зрения, метилирование в экзонах и
интронах может приводить к уменьшению экспрессии на уровне элонгации,
т.к. при метилировании уменьшается доступность хроматина (34),
Из примерно 25 тысяч экспрессирующихся генов АгаЫАоряА ШаНапа,
61 % полностью неметилированы, 5% метилированы в пределах промоторов
и 33 % метилированы в пределах транскрибируемых районов. В последних
уровень метилирования в экзонах и интронах высок, в то время как
промоторы гипометилированы (38,87). Экспрессионный анализ показал, что
для генов с метилированными экзонами и нитронами характерна
конститутивная экспрессия и уровень её в среднем выше, чем у
неметилированных генов (38). Дополнительный анализ свидетельствует, что
метилирование транскибируемых участков независимо от эПША и
контролируется преимущественно МЕТ1 метилтрансферазой по СрС-
динуклеотидам (38,84).
В линии Н1 ЭСК человека обнаружена корреляция между плотностью
тСрО и расстоянием от точки старта транскрипции: плотность тСрО падает,
достигая минимума в точке старта транскрипции, после чего увеличивается в