Кинетические параметры инициации трансляции в эукариотических системах

• Автор: Алехина, Ольга Михайловна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 152 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
I. Введение
II. Обзор литературы
1. Основные механизмы инициации трансляции
2. Особенности эукариотических мРНК
мРНП
Кэп-структура
5'-петранслируемая область мРНК
З'-нетранслируемая область мРНК
Инициаторный кодон и консенсусная последовательность
Альтернативные инициаторные кодоны
3. Механизм 5'-концевой инициации трансляции
Формирование 43 S преинициа горного комплекса
Присоединение 43S комплексов к мРНК
Сканирование 5-НТО мРНК
Узнавание инициаторного кодона
Блокирование рибосомы на инициаторном кодоне
Присоединение 60S рибосомной субчастицы
4. Механизм внутренней инициации трансляции
Структура IRES
IRES-связывающие белки
eIF-пезависимые IRES
5. Регуляция инициации трансляции
Регуляция активности факторов инициации
мРНК-специфическая регуляция инициации
Регуляция инициации 5'-НТО-связывающими белками
Регуляция инициации З'-НТО-связывающими белками
Стимуляция трансляции поли(А)-связывшощим белком

Регуляция трансляции с помощыо микроРНК

III. Материалы и методы
1. Материалы
1.1 Реактивы и ферменты
1.2 Плазмиды
2. Экспериментальные процедуры
2.1 Конструирование и выделение плазмид
Полимеразная цепная реакция
Рестрикция плазмид
Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
Лигирование
Трансформация Е. coli
Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.3 Транскрипция in vitro
2.4 Котранскрипционное кэппировапие мРНК
2.5 Электрофорез РНК в агарозном геле в денатурирующих условиях
2.6 Определение концентраций ДНК и РНК
2.7 Трансляция in vitro
Трансляция в системе из зародышей пшеницы
Трансляция в бесклеточной системе Кребс
2.8 Вычисление полного времени трансляции
2.9 Определение transit time методом импульсной метки
2.10 Электрофорез белков в полиакриламидном геле
2.11 Анализ полисом методом скоростного зонального
ультрацентрифугирования в градиентах сахарозы
IV. Результаты
1. Исследование кинетических параметров сканирования в процессе кэп-зависимой инициации трансляции в эукариотических бесклеточных системах
1.1 Мониторинг синтеза люциферазы в бесклеточных системах

трансляции в реальном времени
1.2 Метод точного определения продолжительности синтеза одной белковой цепи
1.3 Конструирование мРНК люциферазы с 5'-НТО различной длины на основе лидера из ретротранспозона LINE-1 человека
1.4Зависимость полного времени трансляции от длины 5'-нетранслируемой области мРНК
1.5 Определение вклада разных этапов трансляции в изменение времени синтеза белковой цепи
1.6 Установление постоянства скорости элонгации для мРНК люциферазы с 5-НТОразличной длины
1.7 Влияние вставки IRES последовательности в 5'-НТО различной длины на время трансляции мРНК
1.8 Влияние элементов вторичной структуры 5'-НТО на скорость сканирования
1.9 Определение скоростей сканирования 5'-НТО и процесса элонгации в эукариотических бесклеточных системах трансляции
2. Исследование инициации трансляции на некэппированных мРНК в бесклеточной системе из зародышей пшеницы
2.1 Эффект увеличения скорости белкового синтеза в ходе трансляции мРНК люциферазы с очень короткой 5'-НТО
2.2 Влияние 5-НТО на эффект ускорения трансляции
2.3 Влияние длины З'-НТО на эффект ускорения белкового синтеза
2.4 Влияние кэппирования и полиаденилирования мРНК на эффект ускорения трансляции
2.5 Измерение transit time в бесклеточной системе из зародышей пшеницы
2.6 Анализ полирибосом в бесклеточной системе трансляции
2.7 Влияние добавления кэп-аналога на эффект ускорения белкового синтеза
2.8мРНК, усиливающие трансляцию других матриц в бесклеточной системе из зародышей пшеницы
участвовать в созревании транскриптов РНК-полимеразы III. Вирусная инфекция вызывает перераспределение значительной части La белка из ядра в цитоплазму, и в этом случае он становится фактором трансляции для полиовирусной РНК.
р57 (или РТВ - Pyrimidine Tract Binding Protein) - другой РНК-связывающий белок со специфическим сродством к IRES структуре практически всех пикорнавирусных РНК. Было обнаружено, что этот белок является обязательным для инициации трансляции на РНК пикорнавирусов. По-видимому, он связывается со структурированными участками пикорнавирусных IRES и стабилизирует их специфическую активную конформацию. Так же как и в предыдущем случае, р57 оказался идентичен ядерному белку, ранее известному как РТВ, который связывается преимущественно с полипиримидиновыми последовательностями вблизи 3'-концов интронов пре-мРНК. Этот белок принадлежит семейству РНК-связывающих белков с четырьмя РНК-связывающими доменами (RBD), но не содержит типичных RNP-1 и RNP-2 мотивов.
Другие РНК-связывающие белки, такие как р38 и р97, также могут принимать участие в IRES-зависимой инициации трансляции. Однако, до сих пор не найдено универсального фактора, необходимого для внутренней инициации на всех IRES. Это свидетельствует о том, что роль различных РНК-связывающих белков, специфически взаимодействующих с различными IRES, может заключаться в стабилизации структуры IRES, а не в их прямом участии в процессе внутренней инициации трансляции.
eIF-независимые IRES. Кроме IRES, для функционирования которых требуются стандартные эукариотические факторы инициации (elFs), а также в ряде случаев дополнительные факторы (ITAFs), существуют также IRES, частично или полностью не зависимые от факторов. Классическим примером является IRES из РНК вируса гепатита С (HCV). Этот IRES состоит из 350 нуклеотидных остатков, свернутых в специфическую пространственную структуру, которая может связываться с 40S рибосомной субъединицей, в основном, на внешней стороне ее боковой лопасти, но с «хвостом», заходящим на внутреннюю (контактирующую) поверхность в районе «шеи» субчастицы. При этом инициаторный кодой, расположенный на З'-конце IRES, оказывается в непосредственной близости от Р-сайта рибосомы. Последующее взаимодействие с тройственным комплексом