Молекулярные механизмы межвидовых барьеров в передаче прионного состояния у дрожжей

• Автор: Афанасьева, Евгения Георгиевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Межвидовая передача прионных болеваний
2. Аминокислотные замены в белке РгР, влияющие на передачу прионов
3. Прионы низших эукариот
4. Дрожжевые модели для изучения межвидовой передачи прионов
5. Межвидовая передача приона [СЛЕЗ]
6. Прион [РЕ/' ]
7. Передача прионного состояния между белками 8ир35 из дрожжей, относящихся к разным родам
8. Передача прионного состояния между белками БирЗ 5 из близкородственных видов дрожжей
9. Мутации в гене Бир35, влияющие на передачу [Р67+]
10. Заключение. Постановка задачи исследования
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Среды, штаммы, условия культивирования
2. Конструирование плазмид и другие генно-инженерные манипуляции
2.1. Молекуляное клонирование
2.2. Сайт-направленный мутагенез
3. Генетические методы

3.1. Процедура смены плазмид в штаммах 22V-H63AS и 74-D694AS
3.2. Индукция [PST] на гибридных белках Sup35 в клетках S. cerevisiae
3.3. Оценка способности гибридных генов дестабилизировать [Р57+]
3.4. Оценка передачи прионного состояния от Sup35-cer гибридным белкам Sup35
3.5. Трансформация дрожжей S. cerevisiae
3.6. Приготовление компетентных клеток E. coli
3.7. Трансформация Р. coli
4. Приготовление и фракционирование дрожжевых лизатов
5. Белковый гель-электрофорез, иммуноблоггинг
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Гибридные белки Sup35 активны в терминации трансляции
2. Гибридные белки Sup35 способны переходить в прионное состояние
в клетках S. cerevisiae
3. Совместная экспрессия гена SUP35 S. cerevisiae и гибридных генов SUP35 приводит к вариант-специфичны.м эффектам по отношению к [Р57+]
3.1. Экспрессия гибридных генов SUP35 снимает супрессорный фенотип
3.2. Гибридные белки Sup35 способны дестабилизировать [AS71]
4. Барьеры в передаче [Р5Т] между близкородственными белками Sup35
4.1. Эффективность передачи прионного состояния зависит как от белков Sup35,
так и от варианта [PSE]
4.2. Передача одного варианта [KST* ] может приводить к появлению нескольких
разных вариантов [Р5Т1] на гибридном Sup35
5. Гибридные белки Sup35 способны кополимеризоваться с прионными полимерами Sup35 S. cerevisiae без передачи им прионного состояния

5.1. Определение уровня кополимеризации гибридных белков 8ир35 с прионными полимерами 8ир35-сег методом модифицированного
белкового электрофореза в ПААГ
5.2. Анализ включения гибридных белков 8ир35 в прионные полимеры
6. Выявление областей прионного домена 8ир35, ответственных за барьер
в прионной передаче
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Гибридные белки БирЗб принимают ненаследуемую амилоидную укладку
2. Молекулярная модель взаимодействия гетерологичного Бир 35 с прионной формой Бир35 У сегєуіхіае
3. Участки прионного домена БирЗб, ответственные за барьер на пути
передачи прионного состояния
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

5'-GGGAGATCTCAGCT-3'
3 ’ -CCC.TCTAGAC-5'
Таким образом, из промоторной области был удалён сайт BainHl, и на его место вставлена последовательность с сайтом рестрикции Де/11. Удаление сайта ВашН1 было необходимо вследствие наличия сайта BamHl в последовательности гена SUP35 с последовательностью, кодирующей ЗНА тэг. Таким образом, отсутствовала возможность клонирования последовательностей, кодирующих прионные домены, по сайту BamHl. Плазмида с сайтами В gill и Eel 13611 была названа pRS315-SBSE-BglII.
Плазмиды серии pRS315-SUP35-X, несущие гены SUP35 без
последовательности, кодирующей ЗНА тэг, были получены из плазмид серии pRS315-SUP35-3HA-X и плазмиды pRS316-SUP35, путём переклонирования фрагмента длиной 731 и.о., содержащего часть последовательности гена SUP35, из плазмиды pRS316-SUP35, обработанной рестриктазами Bell и Sail, в плазмиды pRS315-SUP35-X, из которых был предварительно удалён соответствующий фрагмент обработкой рестриктазами Bell и Sail.
Мультикопийные плазмиды серии pSBSE-N-X, несущие гибридные гены SUP35 без последовательности, кодирующей ЗНА тэг, были получены из плазмид серии pRS315-SUP35-X и плазмиды pSBSE путём переклонирования фрагментов Xhol-Sall плазмид серии pRS315-SUP35-X с последовательностями, кодирующими прионные домены белков Sup35, в плазмиду pSBSE, предварительно обработанную рестриктазами Xhol и Sail.
Плазмиды с химерными генами SUP35-bay/cer и SUP35-cer/bay, pRS315-SUP35-bay/cer и pRS315-SUP35-cer/bay, были получены перетасовкой фрагментов Mlul-Pstl между плазмидами pRS315-SUP35-cer и pRS315-SUP35-bay. Аналогичным образом были получены плазмиды pRS315-SUP35-par/cer и pRS315-SUP35-cer/par, несущие