Новая стратегия использования генов антимикробных пептидов из яда членистоногих в качестве генотерапевтических агентов

• Автор: Лазарев, Василий Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 245 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ
1.1.1. Классификация антимикробных пептидов
1.1.2. Механизм действия АМП
1.1.2.1. Альтернативные механизмы действия АМП
1.1.2.2. Иммуномодулирующая активность АМП
1.1.3. Резистентность микроорганизмов к АМП
1.1.4. Терапевтическое применение АМП
1.1.4.1. Индукция экспрессии АМП
1.1.4.2. АМП в воспалительном процессе
1.1.4.3. АМН в терапии инфекционных заболеваний
1.1.5. Линейные амфипатические а-спиральные пептиды из ядов членистоногих
1.2. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ
1.2.1. Генная терапия инфекционных заболеваний
1.2.1.1. Генотерапевтические агенты - нуклеиновые кислоты
1.2.1.2. Генотерапевтические агенты — белки
1.2.1.3. Мишени для генетической терапии инфекционных заболеваний
1.2.2. Системы доставки генетического материала
1.2.2.1. Барьеры на пути ДНК в ядро клетки
1.2.2.2. Липидные векторы
1.2.2.3. Другие невирусные системы доставки генетического материала
1.2.3. Генетическая терапия с использованием генов антимикробных пептидов
1.2.4. Системы регуляции экспрессии генов
1.2.4.1. Молекулярные механизмы тетрациклин-зависимой регуляции экспрессии
1.2.4.2. Фармакология доксициклина
1.3. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТА ИССЛЕДОВАНИЯ
1.3.1. Микоплазмы
1.3.2.Хламиди и
1.3.3. Белки мембраны включения хламидий

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Конструирование рекомбинантных плазмид, экспрессирующих гены антимикробных пептидов
2.2. Тестирование рекомбинантных плазмид, экспрессирующих гены антимикробных пептидов в инфицированных Mycoplasma hominis и Chlamydia trachomatis линиях клеток эукариот
2.3. Транскриптомное и протеомное профилирование
2.4. Тестирование рекомбинантных плазмид, экспрессирующих гены
антимикробных пептидов на инфицированных лабораторных животных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. СОЗДАНИЕ И ИСПЫТАНИЯ ПРОТОТИПОВ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ГЕНОВ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ. ФОРМИРОВАНИЕ МОДЕЛИ
3.1.1. Получение и тестирование in vitro рекомбинанных конструкций, экспрессирующих ген антимикробного пептида мелиттина
3.1.1.1. Плазмидные конструкции с конститутивной экспрессией гена
3.1.1.2. Плазмидные конструкции с регулируемой экспрессией гена
3.1.1.3. Тестирование рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген мелиттина в инфицированных Mycoplasma hominis и Chlamydia trachomatis линиях клеток
HeLa/Tet-On и HeLa/Tet-Off
3.1.2. Получение и тестирование in vivo рекомбинанных конструкций, экспрессирующих ген антимикробного пептида мелиттина
3.1.2.1. Создание инфекционной модели M.hominis
3.1.2.2. Создание инфекционной модели C.trachomatis
3.1.2.3. Получение плазмидных конструкций, экспрессирующих ген мелитина для экспериментов in vivo
3.1.2.4. Тестирование рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген мелиттина
у мышей, инфицированных M.hominis и C.trachomatis
3.1.2.5. Тестирование рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген мелиттина
у цыплят-бройлеров, инфицированных M.gallisepticum
3.2. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТОТИПОВ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ГЕНОВ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ

3.2.1. Влияние экспрессии гена мелиттина на транс-мембранный потенциал и состояние редокс-системы клетки
3.2.1.1. Изменение трансмембранного потенциала при экспрессии гена мелиттина
3.2.2. Роль внутриклеточного восстановленого глутатиона в развитии инфекции Chlamydia trachomatis
3.2.2.1. Начальная фаза инфекции Chlamydia trachomatis и глутатион
3.2.2.2. Влияние экспрессии гена мелиттина на концентрацию глутатиона в клетке
3.2.2.3. Определение концентрации GSH после обработки клеток бутионин сульфоксимином (BSO)
3.2.2.4. Влияние NAC (1Ч-ацетил-Ь-цистеина) на уровень внутриклеточного восстановленного глутатиона
3.2.2.5. Влияние BSO и NAC на развитие инфекции C.trachomatis
3.2.2.6. Концентрация GSH, жизнеспособность клеток и развитие хламидийной инфекции при обработке клеток перекисью водорода
3.2.2.7. Дифференциальный протеомный анализ клеток линии HeLa при обработке GSH-модулирующими агентами
3.2.2.8. Транскрипционное профилирование клеток при обработке GSH-модулирующими агентами
3.3. ТРАНСКРИПТОМНЫЙ И ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН МЕЛИТТИНА
3.3.2. Протеомное профилирование клеток, экспрессирующих ген мелиттина
3.3.1. Транскриптомное профилирование клеток, экспрессирующих ген мелиттина
3.4. БЕЛКИ МЕМБРАНЫ ВКЛЮЧЕНИЯ C.TRACHOMATIS
3.4.1. Получение рекомбинантных конструкций, экспрессирующих гены Inc-белков для определения их локализации внутри клетки
3.4.2. Определение локализации Inc-белков С. trachomatis при экспрессии их генов в клетках линии HeLa
3.4.3. Ко-локализации Inc-белков С. trachomatis с эукариотическими органеллами при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HeLa
3.4.4. Определение влияния таксола и брефелдина А на распределение составного белка GFP-IncC при экспрессии кодирующего его гена в клетках линии

что в клетках, приобретающих резистентность к мелиттину, наблюдается снижение копий гена ras, падение продукции онкопротеина и возвращение клеток к нормальной морфологии при четком дозозависимом эффекте. Биохимическая основа этого процесса заключается в гиперактивации мелиттином клеточной фосфолипазы А 2 в ras-трансформированных клетках и усилении эффлюкса ионов кальция [466]. В недавней работе мелиттин был включен в состав наночастиц, состоящих из водно-масляной эмульсии и перфтороктилбромида (PFOB). После внутривенного и местного применения наночастиц у мышей с меланомой В16 наблюдалась значительная регрессия опухоли [482]. В последнее время мелиттин активно применяется в качестве агента для терапии различных видов опухолей [221, 562 589]. Лидирующей формой применения (по количеству исследований) являются наночастицы.
Не менее интересен вопрос и о влиянии мелиттина на пути передачи сигнала в клетке. Известно, что некоторые катионные амфипатические пептиды стимулируют нуклеотидный обмен посредством GTP-связывающих белков [91, 216, 217, 432]. Мелиттин также ингибирует активность аденилатциклазы в синаптических мембранах. Мелиттин стимулирует активность семейства белков G;/G0 (GTP-связывающие белки) в различных типах клеток, что, возможно, связано с его амфифильной структурой [307, 459, 597], также ингибирует белки Gs, путем уменьшения аффинности к нему GTP (или GTP-y-S) или аффинности GDP к Gs [165]. Примечательно, что мелиттин является первым мстабостатическим пептидом, который ингибирует активность семейства G-белков.
Как уже говорилось выше, мелиттин неселективно индуцирует пермеабилизацию мембран как про-, гак и эукариот [384]. Это является базисом его гемолитической, антимикробной [48, 387], антигрибковой [357], антиопухолевой [221, 404, 562] и антипротозойной [605] активностей. Последняя сегодня представляет особенный интерес в области терапевтического использования АМП, в том числе и меллитина. Простейший паразит эукариот Leishmania является возбудителем лейшманиоза, которым заражено около 12-14 миллионов человек в мире [214, 467]. Продемонстировано, что гибрид цекропин А-мелиттин обладает выраженной активностью против лейшманий, но в тоже время не является литическим фактором для клетки-хозяина [16, 96, 134, 312]. Интересно, что наибольшая активность этого гибрида наблюдалась в отношении плазматической мембраны промастигот, в то время как амастиготная форма лейшмании оказалась более резистентной к гибридному пептиду. Более того, N-концевое ацилирование гибридной молекулы приводило к повышению ее ингибирующей активности.