Лектины бобовых растений как инструмент для создания новых симбиотических систем

• Автор: Вершинина, Зиля Рифовна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 145 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений и условных обозначений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Разнообразие азотфиксирующих микробно-растительных симбиозов в природе

1.1.1. Общие положения

1.1.2. Эндосимбиозы

1.1.3. Эктосимбиозы

1.2. Сходства и различия бобово-ризобиального и актиноризного

симбиозов

1.2.1. Инфекционный процесс и клубенекобразование

1.2.2. Гены симбиотической азотфиксации и их регуляция
1.2.3. Специфичность симбиоза
1.3. Роль лектинов в азотфиксирующем симбиозе
1.3.1. Общая характеристика лектинов растений
1.3.2. Лектины бобовых растений
1.3.3. Функции лектинов в азотфиксирующем симбиозе
1.4. «Бородатые корни» как модель корневой системы в симбиотических взаимодействиях
1.5. Биоинженерия симбиотических систем
Глава 2. Экспериментальная часть
2.1. Объекты исследования, бактериальные штаммы и векторы
2.2. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при проведении ПЦР генов лектинов
2.3. Реактивы и материалы

2.4. Составы использованных стандартных водных растворов
2.5. Методы исследований
2.5.1. Выделение и очистка ДНК растений
2.5.2. Выделение и очистка РНК растений
2.5.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.5.4. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях
2.5.5. Подготовка компетентных клеток E.coli
2.5.6. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК
2.5.7. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом
2.5.8. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2.5.9. Синтез кДНК
2.5.10. Полимеразная цепная реакция
2.5.11. Клонирование генов пектинов бобовых растений в вектор pCAMBIA 1305
2.5.12. Приготовление компетентных клеток Agrobacterium sp
2.5.13. Электропорация клеток Agrobacterium sp
2.5.14. Получение композитных растений
2.5.15. Анализ ß-глюкоуронидазной (gus) активности
2.5.16. Агробактериальная трансформация листовых пластинок табака
2.5.17. Обработка «бородатых корней» на люцерне, астрагале и облепихе микросимбионтами
2.5.18
2.5.19. Идентификация клубенекобразующего штамма
2.5.20. Микроскопирование клубеньков, образованных на «бородатых корнях» облепихи

Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Клонирование химерных конструкций гена лектина в бинарном векторе pCAMBIA 1305
3.2. Получение трансгенных «бородатых корней» и композитных растений
3.2.1.Получение «бородатых корней» на люцерне посевной
3.2.2. Получение «бородатых корней» на астрагале нутовом
3.2.3. Получение «бородатых корней» на облепихе крушиновидной
3.2.4. Получение «бородатых корней» на рапсе
32.5. Получение «бородатых корней» на листовых пластинках табака
3.2.6. Получение композитных растений
3.3. Обработка трансгенных корней микросимбионтами и анализ
полученных клубеньков
3.3.1. Эксперименты над композитными растениями люцерны
3.3.2. Эксперименты над композитными растениями астрагала с PSL
3.3.3. Эксперименты над композитными растениями облепихи
3.3.4. Эксперименты над композитными растениями рапса и «бородатыми корнями», полученными на листовых пластинках табака
3.4. Создание полностью трансгенных по гену лектина растений
3.4.1. Создание полностью трансгенных по гену лектина PSL растений табака
3.4.2. Спонтанная регенерация трансгенных по гену лектина PSL
проростков астрагала из культуры «бородатых корней»
Заключение
Выводы
Список литературы

viciae (Diaz et al., 1989). При этом замена аминокислоты в углеводсвязывающем участке гена лектина подавляла или заметно уменьшала число растений клевера, инфицированных R. leguminosarum bv. viciae (van Eijsden et all., 1995). Также были получены растения Lotus corniculatus, содержащие ген лектина сои и образующие клубенькоподобные структуры при их инокуляции В. japonicum - симбионтом сои, но не видов Lotus spp. (Hirsh et al., 1995). Инкубация бактерий В. japonicum, флавоноидом генистеином, индуктором nod генов, увеличивало количество псевдоклубеньков на трансгенных растениях Lotus comiculatus, но дальнейшие исследования показали, что для расширения хозяйской специфичности трансгенным Lotus corniculatus, экзополисахариды поверхности В. japonicum важнее, чем синтез Nod факторов (van Rhijn et al., 1998). Лектин гороха, интродуцированный в красный клевер, вызывал формирование псевдоклубеньков на корнях растений при инокуляции не только ризобиями гороха, но и люцерны и чечевицы (Diaz et al., 2000).
Также существуют работа, описывающая влияние гибридных пектинов, представляющих собой полноразмерный лектин гороха Pisum sativum (PSL) с углеводсвязываюгцим участком, замещенным на таковые пектинов донника белого Melilotus albus (PSL/MAL) и астрагала солодколистного Astragalus glycyphyllos (PSL/AGL), на симбиоз бобовых растений с ризобиями. Обработка пектином гороха PSL ризобий R. leguminosarum bv. viciae в ризосфере люцерны Medicago sativa привела к формированию на корнях данного растения неинфицированных псевдоклубеньков, в то время как обработка гибридным пектином PSL/AGL вызвала у бактерий из клубеньков Astragalus cicer способность образовывать на люцерне инфицированные клубеньки (Баймиев и др., 2009).
Участие пектинов в актиноризном симбиозе не доказано, однако, Chaboud с соавторами (1983) провели ряд экспериментов, в которых штаммы Frankia из Ainus и Elaeagnus были обработаны пектинами с различной углеводспецифичностью. При этом пектины, связывающие N-