Динамика формирования и структурная организация эукариотических полирибосом

• Автор: Афонина, Жанна Аркадьевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 146 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. История открытия полирибосом
Глава 2. Распределение рибосом на мРНК в полирибосомах и загруженность
мРНК рибосомами
Глава 3. Полирибосомы in vivo и in vitro и другие формы организации рибосом.
Электронно-микроскопические исследования
3.1 Полирибосомы прокариот
3.2 Эукариотические полирибосомы
3.2.1 Мембранно-связанные полирибосомы
3.2.2 Свободные цитоплазматические полирибосомы
3.3 Полирибосомные структуры со спиральной организацией
3.4 Микрокристаллы рибосом в клетках
Глава 4. Гипотеза «циркулярной трансляции» в полирибосомах
4.1 Первые свидетельства в пользу гипотезы «циркулярной трансляции»
4.2 Роль фактора инициации eIF4F и поли(А)-связывающего белка в циркуляризации кэпированной полиаденилированной мРНК
4.3 Белки, предположительно участвующие в циркуляризации мРНК с неканоническими нетранслируемыми областями
4.4 Заключение
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
МАТЕРИАЛЫ
1.1 Реагенты

1.2 Оборудование
1.3 Плазмиды
МЕТОДЫ
1.1 Трансформация клеток E. Coli
1.2 Выделение и очистка плазмидной ДНК
1.3 Обработка плазмид эндонуклеазами рестрикции
1.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле
1.5 Обработка плазмиды pTZßG-SBP-CBP-GFP-AUTR, линеаризованной по сайту
рестрикции Pvul, фрагментом Кленова
1.6 Котранскрипционное кэпирование (транскрипция in vitro)
1.7 Транскрипция in vitro
1.8 Полиаденилирование мРНК с помощью поли(А)-полимеразы
1.9 Химическая модификация З'-конца мРНК cap-5TJTRß.giObm-sc6F.P-3'UTR40(A)30
флуоресцеин-5-тиосемикарбазидом (FTSC)
1.10 Обработка мРНК РНКазой Н
1.11 Электрофорез РНК
1.12 Трансляция в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы
1.13 Определение концентрации GFP
1.14 Измерение активности люциферазы
1.15 ТХУ-анализ проб трансляции, содержащих [14С]пептиды
1.16 Выделение 40S рибосомных субчастиц из пшеничного экстракта
1.17 Анализ полирибосом методом скоростного зонального
ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы

1.18 ТХУ-анализ фракций сахарозного градиента, содержащих меченные изотопом углерода [|4С]пептиды
1.19 Определение радиоактивности во фракциях сахарозного градиента по Черенкову
1.20 Выделение полисомной [32Р]мРНК из фракций сахарозного градиента
1.21 Выделение полирибосом методом гель-хроматографии на основе Sephacryl S500 HR для анализа полирибосом методом электронной микроскопии
1.22 Электронно-микроскопический анализ фракций гель-хроматографии методом негативного контрастирования
1.23 Электронно-микроскопический анализ системы трансляции методом негативного контрастирования
1.24 Анализ полирибосом методом криоэлектронной томографии
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ
ЧАСТЬ 1. ФОРМИРОВАНИЕ ПОЛИРИБОСОМ В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ
Глава 1.1. Динамика формирования полирибосом на кэпированных мРНК
Глава 1.2. Динамика формирования полирибосом на некэпированных мРНК
Обсуждение результатов части
ЧАСТЬ 2. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ПОЛИРИБОСОМ
Глава 2.1. Трансляционная активность «легкой» и «тяжелой» фракций полирибосом

Обсуждение результатов главы
Глава 2.2. Обмен полисомных рибосом со свободными рибосомами
Глава 2.3. Влияние избытка конкурентной мРНК на трансляцию полисомной мРНК

программа lmagic - Image Science Software GmbH, Germany.
1.3 Плазмиды
Плазмиды, использованные в работе:
1. В плазмиде pTZßG-SBP-CBP-GFP-АЗО под контролем Т7-промотора находится последовательность мРНК, содержащая 5-НТО мРНК ß-глобина кролика, кодирующую последовательность зеленого флуоресцентного белка («сус1еЗ» мутант) с N-концевой аффинной последовательностью SBP-CBP (стрептавидин- и кальмодулин связывающие пептиды, в названиях мРНК используется сокращение «sc») и С-концевой аффинной последовательностью с 6 Гис, и З'-концевую последовательность А30. Последовательность GFPcycle3 была амплифицирована в ПЦР с вектором pBAD-GFP (Maxigen) и праймерами 5’GATATACATATGGCTAGCAAAGGAGAAGAAC и 5'GACCATGGCCTTTGTAGAGCT CATCCATGCCATG; последовательность SBP-CBP-тага - в ПЦР с вектором рСТАР-А (Stratagene) и праймерами 5’CAGTGCTAGCATGGACGAGAAGACCACCGG и 5'CTGTCT AG АА AGT GCCC С GG AGGAT GAG. Последовательность 5'-НТО мРНК ß-глобина кролика была синтезирована достройкой комплементарных праймеров
5'АТ AAGCTTC AC ACTTGCTTTT G AC AC A ACT GT GTTT АСТТ GC А и 5TTGGCCATTC TGTCTGTTTTGGGGGATTGCAAGTAAACACAGTTGT. Все праймеры содержали сайты рестрикции (подчеркнуты) для последующего клонирования. Последовательность Азо с фланкирующими участками (в том числе спэйсером длиной 50 нуклеотидных остатков) вырезана из вектора pCITE-4a(+) (Novagen) с помощью Х1ю и Spei. Плазмида pTZßG-SBP-CBP-GFP-A30 сконструирована в несколько этапов с помощью стандартных методов, клонируемая последовательность вставлена между сайтами Hindlll и Sali вектора pTZ19R (Novagen), нуклеотидная последовательность подтверждена секвенированием района вставки.
2. Плазмида pTZßG-SBP-CBP-GFP-A50 была получена из плазмиды pTZßG-SBP-CBP-GFP-A30 (1) путем замены З'-концевой последовательности А3о на А50. Для этого из плазмиды (1) был вырезан фрагмент BgRl-Xbal, содержащий А3о; вместо него был вставлен фрагмент ДНК, полученный путем гибридизации праймеров 5’CTAGAGCAATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT ТAAAGGGCCCА и 5'GATCTGGGCCCTTTААААААААААААААААААААААА AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATTGCT. Вставка содержала А50 и сайт рестрикции Sip 1201, находящийся после поли(А)-последовательности (подчеркнут).