Поиск и идентификация нарушений экспрессии генов в различных опухолях человека

• Автор: Краснов, Георгий Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 с. : ил.

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Методы исследования транскрипции генов

1.1.1. Нозерн-блоттинг

1.1.2. Вычитающая гибридизация

1.1.3. Дифференциальный скрининг

1.1.4. Метод защиты от рибонуклеазы

1.1.5. Количественные методы

1.1.6. Серийный анализ экспрессии генов (SAGE) :

1.1.7. Массовое параллельное секвенирование сигнатур
1.1.8. Микрочипы
1.1.9. Метод EST
1.1.10. Высокопроизводительное секвенирование
1.1.11. Сравнение описанных технологий
1.2. Особенности ПЦР в реальном времени
1.2.1. Метод двойного сравнения и нормирование
1.2.2. Основные методы расчёта эффективности ПЦР
1.2.3. Программы, предназначенные для обработки количественных данных метода ПЦР в реальном времени
1.2.4. Проблема выбора контрольных генов
1.3. Современные маркеры онкологических заболеваний
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Метод анализа базы данных EST и программа CompEST
2.1.1. Нормирование числа тагов с использованием контрольных генов
2.1.2. Отбор потенциальных контрольных генов
2.1.3. Отбор генов с потенциально изменённым уровнем экспрессии
2.1.4. Идентификация часто встречающихся нарушений сплайсинга
2.2. Выбор генов с потенциально изменённым уровнем мРНК в опухоли для различных видов рака с помощью CompEST

2.2.1. Поиск генов хромосомы 3 с изменённым уровнем экспрессии
при раке лёгкого и почки
2.3. Новая модель расчёта эффективности ПЦР-РВ
2.3.1. Программа АТГ для расчёта результатов ПЦР-РВ
2.4. КРЯ1 — новый контрольный ген для нормирования данных ПЦР-РВ в опухолях лёгкого и почки
2.4.1. Применение СошрЕвТ для отбора потенциальных
контрольных генов
2.4.2. Экспериментальная проверка РРМ в качестве контрольного гена
2.5. Сравнительный анализ экспрессии генов РТЬ и РТН, кодирующих субъединицы ферритина, при раке лёгкого
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений
ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay, иммуноферментный анализ; EST — expressed sequence tag, экспрессируемый фрагмент последовательности;
NCBI - National Center for Biotechnology Information;
SAGE - serial analysis of gene expression, серийный анализ экспрессии генов; TSG - tumor suppressor gene, ген-супрессор опухолевого роста;
БД - база данных;
ИГХ - иммуногистохимический анализ;
HMPJI - немелоклеточный рак лёгкого;
ОТ-ПЦР - ПЦР с обратной транскрипцией;
ПКРЛ - плоскоклеточный рак лёгкого;
ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени;
РТК - рак толстой кишки;
СПР — светлоклеточный почечноклеточный рак.
Обозначения генов:
FTH - ferritin, heavy polypeptide; ферритин, тяжёлая цепь;
FTL - ferritin, light polypeptide; ферритин, лёгкая цепь;
GAPDH- glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа;
GUSB - glucuronidase, beta; бета-глюкуронидаза;
RPN1 - ribophorin I; рибофорин I.

1.2.2. Основные методы расчёта эффективности ПЦР
Все методы расчёта эффективности ПЦР могут быть разделены на две большие группы. Первая группа включает в себя один основной метод расчёта и множество его модификаций. Этот метод заключается в использовании так называемой стандартной кривой, представляющей собой зависимость значения порогового цикла Сч, на котором достигается заданный (пороговый) уровень флуоресценции, от логарифма начальной концентрации ДНК (кДНК или геномной ДНК). В идеальных условиях такая зависимость должна представлять собой прямую. В реальных условиях эта прямая проводится в соответствии с методом наименьших квадратов. Значения Е вычисляется по наклону полученной прямой, но для расчётов её значение получать не обязательно - начальные концентрации вычисляются напрямую по значению функции, описывающей эту прямую, при заданном пороговом цикле. Среди модификаций этого подхода стоит упомянуть различные методики исключения выпадающих точек.
Вторая группа состоит из различных методов, предполагающих вычисление эффективности непосредственно из кинетической кривой. Несмотря на большое разнообразие методов этой группы, в подавляющем большинстве современных научных работ используется, в основном, метод стандартной кривой. Это объясняется тем, что по кинетической кривой эффективность может быть рассчитана недостаточно точно - ПЦР представляет собой сложный процесс, описать кинетику которого представляется достаточно трудоёмкой задачей, как в плане создания математических моделей, так и в плане дальнейшей разработки по ним вычислительных методов. Тем не менее, эта группа методов обладает очевидным и существенным преимуществом - не требуется многократное построение стандартной кривой, что обеспечивает значительную экономию средств и времени. Наиболее распространённый подход, относящийся ко второй группе, - расчёт значения Е по экспоненциальному участку кинетической кривой реакции. Аналогично методу стандартной кривой, построение проводится в координатах цикл реакции—логарифм значения интенсивности флуоресценции, строится аппроксимирующая прямая, также с использованием метода наименьших квадратов. Существует несколько модификаций этого метода, основанных на придании различного веса точкам с разной относительной точностью значений (чем выше интенсивность флуоресценции, тем мень-