Разработка специфических маркеров для изучения генетического полиморфизма токсигенных грибов рода Fusarium

• Автор: Стахеев, Александр Александрович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Род Fusarium-, общая характеристика
1.1. Основные признаки, характ ерные для представителей рода Fusarium
1.2. История исследований рода: основные достижения и проблемы
1.3. Характеристика микотоксинов, продуцируемых грибами рода Fusarium
2. Краткое описание видов, исследованных в настоящей работе
3. Методы, применяемые для диагностики и идентификации возбудителей фузариоза
3.1. Морфологический анализ и фитопатологическая экспертиза
3.2. Биохимические маркеры и детекция специфических метаболитов
3.3. ДНК-маркеры
4. ПЦР как диагностический метод
4.1. Общие принципы ПЦР
4.2. Основные характеристики и способы оптимизации реакции
4.3. Основные варианты метода ПЦР и их применение в диагностике и идентификации 64 возбудителей фузариоза
4.4. Особенности метода ПЦР в реальном времени
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Реактивы, оборудование, штаммы грибов, образцы зерна
2. Методы выделения ДНК
3. Анализ последовательностей ДНК и белков; подбор праймеров
4. Проведение ПЦР
5. Детекция результатов ПЦР
6. Анализ результатов RAPD и 1SSR
7. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР; разработка положительных контролей
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Общая стратегия исследований
2. Анализ генетического разнообразия штаммов всероссийских коллекций
2.1. Выбор локусов для MLST-анализа и подбор универсальных праймеров
2.2. Анализ отсеквеиироваиных последовательностей
2.3. RAPD- и ISSR- анализ
3. Разработка систем ПЦР-идентификации возбудителей фузариоза
3.1. Подбор специфических праймеров и зондов
3.2. Экспериментальная проверка специфичности праймеров
3.3. Оценка эффективности проведения ПЦР-РВ, наличия ингибиторов в смеси и 112 чувствительности реакции
3.4. Анализ полевых образцов заражённого зерна
3.5. Детекция F. culmorum в проростках пшеницы на ранних стадиях заражения. И
3.6. Сравнение разработанных тест-систем с описанными в литературе
ВЫВОДЫ I
БЛАГОДАРНОСТИ I
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БОВ - боверицин
В К - внутренний контроль
ДАС - диацетоксисцирпенол
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДНК-ШК - ДНК-штрихкодирование
ДОН - дезоксиниваленол
ЗЕН - зеараленон
ИФА - иммуноферментный анализ К+ - положительный контроль К- - отрицательный контроль кДа - килодальтон МОН - монилиформин НЕО - неосоланин НИВ - ниваленол п.о. - пар оснований
ПДК - предельно допустимая концентрация
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени
РНК - рибонуклеиновая кислота
рРНК - рибосомальная РНК
ТрМТ - трихотеценовые микотоксины
ФУМ - фумонизины
ЭНН - энниатины
acll - ген большой субъединицы АТФ-цитратлиазы
AFLP - amplified fragment length polymorphism (полиморфизм длин фрагментов амплификации) fi - tub - ген бета-тубулина Cq - quantification cycle (пороговый цикл)

CPR1 - ген НАДФН-цитохром Р450 редуктазы CYP51C - ген стерол-14-а-деметилазы
ELISA - Enzyme-linked immuno sorbent assay (твердофазный иммуноферментный анализ)
Esynl - ген энниатин-синтетазы
FLASH - Fluorescent Amplification based Specific Hybridization (ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов после окончания амплификации)
GFP - green fluorescent protein (зелёный флуоресцентный белок)
IGS - межгенный спейсер рибосомальной ДНК
ISSR - inter sequence simple repeats (межмикросателлитный анализ)
lys2 - ген аминоадипат редуктазы
MLST - multilocus sequence typing (мультилокусное секвенирование-типирование)
NCBI - National Center for Biotechnology Information PHO - ген фосфатпермеазы
RAPD - random amplification of polymorphic DNA (случайная амплификация полиморфной ДНК)
RPB2 - ген 2 субъединицы РНК-полимеразы II
RFLP - restriction fragment length polymorphism (полиморфизм длин фрагментов рестрикции)
SCAR - sequence characterized amplified region (амплифицированный регион с охарактеризованной последовательностью нуклеотидов)
Та - annealing temperature (температура отжига)
Tm - melting temperature (температура плавления)
TEFla - ген фактора элонгации трансляции 1 альфа

Колонии быстрорастущие. Воздушный мицелий хлопьевидный, рыхло- или плотнопушистый, бархатистый, интенсивной оранжевой или тёмно-красной окраски. Макроконидии веретеновидно-серповидные, изогнутые (средняя часть является наиболее широкой), толстостенные, как правило, с 5 перегородками (реже с 3 или 6, рис. 8). Апикальная клетка постепенно сужающаяся, конусообразная, искривленная. Базальная клетка с отчётливо выраженной ножкой. Размер микроконидий - 5-7 х 0-60 мкм (Гагкаева и др., 2011). Микроконидии отсутствуют. Хламидоспоры формируются медленно, но в большом количестве, в цепочках или кластерах, окрашенные (Burges et al., 1982).
Рисунок 8. Макроконидии F. cerealis. (Leslie and Summerell, 2006).
Вид F. cerealis является продуцентом НИВ и его ацетилированных производных, а также ЗЕН (Vesonder et al., 1991). ДОН-продуцирующие штаммы на сегодняшний день не описаны.
2.4. Fusarium culmorum (W.G. Smith) Saccardo.
Половая стадия: не описана
Краткое описание. Встречается в регионах с умеренным климатом. Вызывает фузариоз колоса и корневые гнили у широкого спектра дву- и однодольных растений.
Колонии быстрорастущие. Воздушный мицелий хлопьевидный, рыхло- или плотнопушистый, как правило, бордового, реже коричневого или тёмно-зелёного цвета. Конидиеносцы образуются на гифах воздушного мицелия, в дальнейшем обильно ветвятся. Спородохии образуются быстро, на всей поверхности или в центре культуры, кирпично-красные или красно-коричневые. Макроконидии