Структурно-функциональные особенности "линкерных" белков хроматина HMGB1 и H1

• Автор: Старкова, Татьяна Юрьевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 125 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. СТРУКТУРА ХРОМАТИНА

1.1.1. Первый уровень организации хроматина

Формирование нуклеосомы

1.1.2. 30-нм фибрилла

1.1.3. Петельный уровень организации хроматина

1.2. ЛИНКЕРНЫЙ ГИСТОН Н

1.2.1. Структура гистона Н

1.2.2. Взаимодействие гистона III с ДНК

1.3. НЕГИСТОНОВЫЙ ХРОМОСОМНЫЙ БЕЛОК НМОВ
1.3.1. Структура НМОВ
1.3.2. Взаимодействие НМОВ1 с ДНК
1.3.3. Функции НМОВ1 в клетке
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ «ЛИНКЕРНЫХ» БЕЛКОВ ХРОМАТИНА Н1, НМОВ1 инмввг
2.1.1. Первая экстракция Н1, НМОВ1 и НМОВ
2.1.2. Вторая экстракция Н13 НМОВ1, НМОВ
2.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК МЕТОДОМ ЩЕЛОЧНОГО ЛИЗИСА
2.3.1. Электрофорез в агарозном геле
2.3.2. Денатурирующий электрофорез в ПААГ по методу Лэммли
2.3.3. Двухмерный электрофорез
2.4. МАЛДИ (МАЬЕЯ) МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ
2.5.СПЕКТРОСКОПИЯ КРУГОВОГО ДИХРОИЗМА
2.5.1. Теория кругового дихроизма
2.5.2. Круговой дихроизм белков и пептидов
2.5.3. Круговой дихроизм нуклеиновых кислот
2.6. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ПЛАВЛЕНИЕ ДНК
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. Исследование вторичной структуры и термодинамической стабильности полноразмерного природного белка НМОВ1 в свободном состоянии
3.2. Анализ вторичной структуры белка НМОВ1 в свободном состоянии и при взаимодействии с ДНК
3.3. Исследование термостабильности высокомолекулярной ДНК тимуса теленка в комплексе с негистоновым белком хроматина НМОВ1.
3.4. Сравнительный анализ вторичной структуры белка НМОВ1 в свободном состоянии и при взаимодействии с гистоном Н1
3.5. Выявление посттрансляционных модификаций подтипов липкерного гистона Н
3.6. Сравнительный анализ посттрансляционных модификаций
негистоновых белков хроматина НМОВ1 и НМОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Список публикаций по теме диссертации
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Хроматин эукариотических клеток представляет собой сложный высоко динамичный ДНК-белковый комплекс, структурная организация и функционирование которого напрямую связано с взаимодействием между его структурными элементами: ДНК и белками. При этом регуляция ДНК-белкового и белок-белкового взаимодействия до конца не изучена. С одной стороны, она может включать изменение характера связывания между молекулами путем изменения заряда взаимодействующих участков, например, с помощью введения клеточной системой посттрансляционных модификаций в белках. С другой — включать структурно-адаптивные механизмы, когда в зависимости от объекта связывания, биологические макромолекулы, в частности белки, для перехода в функциональноактивное состояние способны изменять свою пространственную структуру.
Данная работа посвящена исследованию механизмов взаимодействия негистонового хромосомного белка HMGB1 с ДИК и взаимодействующими с ним белковыми молекулами, в частности гистоном Н1.
Белок HMGB1 относится к большому семейству белков HMG (от англ. High Mobility Group). Отличительной особенностью всех белков HMGB группы является наличие в их структуре одного и более ДШС-связывающего «HMGB-домена» — структурного элемента размером порядка 80 аминокислотных остатка, обладающего высокой консервативностью, как аминокислотной последовательности, так и пространственной организации. Белок HMGB 1 и схожий с ним IIMGB2 относятся к группе двух-доменных белков. Основным отличием в их структуре является длина С-концевого фрагмента, в связи с этим, эти два белка очень часто исследуются в тандеме, предполагая, что взаимодействие HMGB-доменов белков с ДНК носит схожий характер. Однако, длина С-концевого участка молекул HMGB1 и HMGB2 может оказывать влияние на их пространственную укладку. В литературе предполагается возможность формирования 2-х типов пространственной укладки молекулы HMGB1: в свернутом (при взаимодействии С-концевого участка белка с ДНК-связывающими доменами) и развернутом состоянии (при нарушении данного взаимодействия, например, изменением заряда контактирующих областей белка), между которыми существует динамическое равновесие. При этом активное для

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ «ЛИНКЕРНЫХ» БЕЛКОВ ХРОМАТИНА Hl, HMGB1 И HMGB
2.1.1. Первая экстракция Hl, HMGB1 и HMGB
Тимус вырезали у теленка (мыши, крысы) сразу после забоя, замораживали, по возможности в жидком азоте, и хранили при температуре -20°С.
Все последующие операции с материалом проводили на холоду в охлаждаемом помещении при температуре не выше +4 °С. Изначально осуществляли первичную очистку мяса от излишков жиров и соединительных тканей. После чего его помещали в гомогенизатор, заливали охлажденным до +4 °С раствором 5% хлорной кислоты, точно фиксируя добавленный объем. Объем кислоты выбирали из соображений, чтобы в гомогенизаторе все ножи были закрыты раствором. Чем меньше объем кислоты, тем более концентрированная надосадочная жидкость (в данном случае, раствор белков в НСЮ4) получится в итоге. Гомогенизация, в ходе которой происходит разрушение клеточных мембран и высвобождение ядер, проводили в течение 3 минут при скорости 15 ООО g.
С целью удаления соединительной ткани и остатков жира полученную массу процеживали через стерильный марлевый фильтр, после чего весь отфильтрованный раствор подвергали центрифугированию в течение 15 минут при +4 °С со скоростью 2000 g. Осевший после центрифугирования осадок (для удобства назовем его «осадок 1») сохраняли и использовали в дальнейшем для получения второй экстракции белков Hl, HMGB1 и HMGB2. Надосадочный раствор для более тщательной очистки попускали через фильтр-Шотта под давлением, создаваемым водоструйным насосом, собирали и помещали на ночь в морозильную камеру при -20°С с добавлением тройного объема ацетона, подкисленного до 0,35 М НС1. В этих условиях линкерный гистон Н1 выпадает в осадок. На утро надосадочный раствор после центрифугирования (4 500g 20 мин 4 °С) собирали и использовали в дальнейшем для осаждения HMGB1 и IIMGB2, а осевший Н1 несколько раз промывали от кислоты чистым ацетоном и высушивали.
К слитому после осаждения гистона Hl надосадочному раствору добавляли тройной объем ацетона и помещали в морозильную камеру при температуре -20 “С