Изучение свойств и молекулярных механизмов действия Rho ГТФазы Chp/Wrch2

• Автор: Шепелев, Михаил Валентинович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 158 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
Список используемых сокращений
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Семейство Rho ГТФаз человека
2.1.1. Введение
2.1.2. Структура Rho ГТФаз и регуляция ГТФазного цикла
2.1.3. Регуляция мембранной локализации Rho ГТФаз
2.2. Подсемейство RholIV
2.3. Rho ГТФаза Chp/RhoV/Wrch2
2.3.1. Экспрессия гена RHOV в нормальных и опухолевых тканях и клеточных
линиях млекопитающих
2.3.2. Регуляция экспрессии гена RHOV
2.3.3. Характеристика белка Chp и его биохимические свойства
2.3.4. Взаимодействие с регуляторными белками и активация ГТФазы Chp
2.3.5. Взаимодействие Chp с предполагаемыми эффекторами
Протеинкиназа Pakl
Протеинкиназы Рак2, РакЗ, Рак4
Другие белки
2.3.6. Внутриклеточная локализация Clip и липидные модификации С-конца
2.3.7. Биологические эффекты ГТФазы Chp
Активация протеинкиназы JNK
Влияние на актиновый цитоскелет
Возможное влияние ГТФазы Chp на процесс митоза
Возможная роль ГТФазы Chp в злокачественной трансформации
Экспрессия и функции ГТФазы Chp в эмбриональном развитии позвоночных26
2.3.8. Резюме
2.4. Rho ГТФаза Wrch-1/RhoU
2.4.1. Экспрессия гена RHOU в тканях и клеточных линиях
2.4.2. Регуляция экспрессии гена RHOU
2.4.3. Характеристика белка Wrch-1 и его биохимические свойства
2.4.4. Взаимодействие с регуляторными белками
2.4.5. Внутриклеточная локализация и липидные модификации С-конца
2.4.6. Взаимодействие с эффекторами
Протеинкиназа Pakl
2.4.8. Протеинкиназы Рук2 и FAK и регуляция Wrch-1 протеинкиназой Src
2.4.9. 8НЗ-домен содержащие белки Nek, Grb2 и PLCy
2.4.10. ARHGAP30 и CdGAP
2.4.11. Биологические эффекты ГТФазы Wrch
Активация JNK
Влияние на актиновый цитоскелет
Возможная роль ГТФазы Wrch-1 в злокачественной трансформации
Влияние ГТФазы Wrch-1 на фокальные контакты
Роль Wrch-1 в дифференцировке остеокластов
Другие эффекты
2.4.12. Резюме
2.5. Эффекторныс молекулы ГТФазы Chp: Семейство протеинкиназ Рак человека46
2.5.1. Общая характеристика семейства протеинкиназ Рак человека
2.5.2. Структура протеинкиназ Рак
2.5.3. Механизмы активации протеинкиназ Рак

Активация протеинкиназ Pak I с участием Rho ГТФаз
Механизмы активации протеинкиназ Pak I без участия ГТФаз
2.5.4. Регуляция активности протеинкиназ Pak II
2.6. Серин-треониновая протеинкиназа Рак5
2.6.1. Ген РАК7 и его экспрессия у млекопи тающих
2.6.2. Свойства и структура протеинкиназы Рак5
2.6.3. Характеристика и регуляция каталитической активности Рак5
2.6.4. Влияние Rho ГТФаз на киназную активнос ть Рак5
2.6.5. Интерактом протеинкиназы Рак5
Взаимодействие Рак5 с Rho ГТФазами
Протеинкиназа MARK2/Par
Протеинкиназа Raf
2.6.6. Внутриклеточная локализация Рак5
Локализация Рак5 на митохондриях
Локализация Рак5 на везикуло-подобных структурах
Ядерная локализация Рак5
Локализация Рак5 на фокальных контактах и центросомах
2.6.7. Влияние Рак5 на актиновый и тубулиновый цитоскелеты
2.6.8. Индукция роста нейритов под влиянием Рак5
2.6.9. Роль Рак5 в активации МАРК сигнальных путей: активация JNK
2.6.10. Ингибирование апоптоза под влиянием Рак5
2.6.11. Экспрессия Рак5 в опухолевых клеточных линиях и образцах опухолей человека
2.6.12. Возможная роль протеинкиназы Рак5 в развитии диабета
2.6.13. Нокаут гена Рак7у мыши
2.6.14. Резюме
2.7. Серин-треониновая протеинкиназа Ракб
2.7.1. Структура Ракб и регуляция киназной активности
2.7.2. Белки, взаимодействующие с Ракб
Rho ГТФазы
Транскрипционные факторы
Другие белки
2.7.3. Экспрессия гена РАК6 в нормальных и опухолевых тканях и возможная роль Ракб в онког енезе
2.7.4. Нокаут гена Ракб
2.7.5. Резюме
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Реактивы
3.2. Бактериальные штаммы, среды, реактивы, антибиотики
3.3. Получение химически компетентных клеток E
3.4. Приготовление электрокомпетентных клеток E.coli XL1 Blue MRF’
3.5. Электропорация бактериальных клеток
3.6. Трансформация клеток E
3.7. Гидролиз ДНК с помощью эндонкуклеаз рестрикции
3.8. Секвенирование ДНК
3.9. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli (мини-преп)
3.10. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli (макси-преп)
3.11. Очистка фрагментов ДНК из агарозного геля и растворов
3.12. Электрофорез ДНК в агарозном геле
3.13. Лигирование фрагментов ДНК
3.14. Клонирование продуктов ПЦР
3.15. Получение плазмидных конструкций
3.16. Культуры клеток, реагенты и трансфекция

3.17. Вестерн-блот анализ и антитела
3.18. Очистка рекомбинантных белков GST и GST-Chp
3.19. Коиммунопреципитация myc-Chp и FLAG-Ракб
3.20. Коиммунопреципитация FLAG-Chp и myc-IRSp53
3.21. Коиммунопреципитация myc-Chp и а-тубулина
3.22. Иммунофлуоресценция
3.23. Анализ формирования филоподий в клетках HeLa В
3.24. Аффинная очистка ГТФазы Clip с FLAG-эпитопом из лизатов клеток РС12ТеЮп
3.25. Масс-спектрометрия
3.26. GST пул-даун анализ с использованием цитозоля клеток HeLa В
3.27. Анализ взаимодействия GST-Chp с микротрубочками полимеризованными in vitro
3.28. Анализ взаимодействия myc-Chp с микротрубочками полимеризованными в лизатах клеток НЕК293
3.29. Гель-оверлей анализ
3.30. Измерение жизнеспособности клеток PC12TetOn
3.31. Измерение активности ЛДГ в культуральной среде
3.32. Измерение активности каспаз
3.33. Проточная цитофлуориметрия
3.34. Анализ активации протеинкиназы JNK в клетках PC12TetOn
3.35. Измерение активности АР-1 репортерного гена
3.36. Статистический анализ
3.37. Анализ белок-белковых взаимодействий в дрожжевой двугибридной системе
3.37.1. Штаммы дрожжей
3.37.2. Среды и реактивы
3.37.3. Трансформация дрожжей плазмидной ДНК
3.37.4. Анализ белок-белковых взаимодействий в дрожжевой двугибридной системе (штамм Y153)
3.37.5. Анализ активации репортерного гена LacZ в дрожжах
3.37.6. Скрещивание штаммов Y187 и CG-1945
3.38. Скрининг библиотеки кДНК в дрожжевой двугибридной системе «Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 2»
3.38.1. Проверка активации транскрипции репортерных генов «приманкой»
3.38.2. Скрещивание штамма CG-1945, содержащего «приманку», со штаммом Y187, трансформированным библиотекой кДНК
3.38.3. Выделение плазмидной ДНК (библиотечной плазмиды) из клеток дрожжей
3.38.4. Анализ LacZл HIS3+ позитивных клонов
3.39. Выделение РНК из клеточных линий и синтез кДНК
3.40 Анализ уровня транскрипта гена RHOVс помощью полуколичественной ПЦР
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Идентификация протеинкиназ Рак5 и Ракб как новых потенциальных эффекторов ГТФазы Clip
4.2. Chp взаимодействует с Ракб в лизатах клеток млекопитающих
4.3. Chp связывается с CRIB-последовательностью в Ракб
4.4. Эффекторный домен Chp необходим для взаимодействия с Ракб
4.5 Chp не влияет на уровень фосфорилирования аминокислотного остатка S560 у
Ракб
4.6. Chp колокализуется с Ракб на везикулярных структурах в клетках NCI-H1299

Анализ внутриклеточной локализации Wrch-1 при стабильной экспрессии в клетках почечного эпителия собаки MDCKII выявил белок Wrch-1 на плазматической мембране преимущественно в базолатеральном домене и на микрошипах на апикальной поверхности. При этом отмечалась частичная колокализация с белками плотных контактов окклюдином и ZO-1 в области латеральной плазматической мембраны, а также с белками адгезионных контактов Е-кадгерином и (3-катенином в базолатеральной области [74]. В целом, это указывает на то, что ГТФаза Wrch-1 может быть локализована на межклеточных контактах в поляризованных эпителиальных клетках.
Культивирование клеток MDCKII в среде, лишенной кальция, вызывает разрушение плотных контактов и интернализацию белков плотных контактов, например ZO-1. При добавлении кальция («calcium switch») происходит восстановление контактов, а перераспределение белка ZO-1 из цитозоля на латеральную поверхность вновь сформированных контактов может служить маркером формирования нормальных плотных контактов. Как выяснилось, активная форма Wrch-1, но не белок дикого типа, при стабильной экспрессии в клетках MDCKII вызывала существенное нарушение локализации белка ZO-1 и его перераспределения после добавления кальция, приводя к значительной временной задержке формирования нормальных плотных контактов [74]. Кроме того, экспрессия Wrch-1 Q107L снижала значения трансэпителиального сопротивления (ТЭС), которое является функциональной мерой целостности эпителиального слоя и, соответственно, формирования плотных контактов. Снижение ТЭС отмечалось лишь на ранних стадиях формирования плотных контактов после добавления кальция (18 ч), и после определенного времени значения ТЭС достигали равновесных значения, которые были сходны для активной формы Wrch-1, белка дикого типа и контрольных клеток, экспрессирующих пустой вектор [74]. Кроме того, при экспрессии Wrch-1 отмечалось увеличение межклеточной диффузии гидрофильных незаряженных молекул (декстран), что также отражает нарушение формирования межклеточных контактов и, соответственно, увеличение проницаемости эпителия [74]. Актиновый цитоскелет тесно связан с процессами динамической перестройки межклеточных контактов. При экспрессии активной формы Wrch-1 отмечались нарушения накопления F-актина на межклеточных контактах, наблюдалась дезорганизация эпителиального монослоя, появление многослойности, разрушение базальных стрессовых фибрилл и пучков актина, ассоциированных с адгезионными контактами [74]. Судя по всему, нарушения динамики актинового цитоскелета, может лежать в основе нарушений эпителиального морфогенеза под влиянием Wrch-1. Му тация F86C в эффекторном домене Wrch-1 Q107L блокировала взаимодействие с Рагб и предотвращала влияние Wrch-1 на процесс формирования плотных контактов. Это отражалось в неспособности влиять на локализацию ZO-1, снижать значения ТЭС и влиять