Белки транспорта кремния SIT

• Автор: Петрова, Дарья Петровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 137 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДАФИ - 4,6-диамидино-2-фенилиндол

ДДС-Na - додецилсульфат натрия

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

СМ - световая микроскопия

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

ТЕМЕД - тетраметилэтилендиамин

тыс.л.н. - тысячь лет назад

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ЦТАБ - цетилтриметиламмоний бромид (цетавлон)
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
GFP - зеленый флуорисцентный белок (Green Fluorescent Protein)
HEP - белки экстрагируемые HF (HF-extractable proteins)
LCPA - длинноцепочечные полиамины (Long-chain Polyamines) PVDF - поливинилиден дифлуорид (Polyvinylidene Difluoride)
SIT - белок транспорта кремния (Silicon Transporter)
SDV - везикула отложения кремнезема (Silica Deposition Vesicle) STV - везикулы транспорта кремнезема (Silica Transport Vesicle)

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Роль кремния в живых организмах
1.2. Общая характеристика диатомовых водорослей
1.3. Систематика диатомей
1.4. Общий план строения панцирей диатомей
1.5. Морфогенез элементов панцирей
1.6. Белки, предложенные на роль участников морфогенеза элементов кремнистых панцирей
1.7. Белок транспорта кремния
1.8. Гипотеза макропиноцитоза
1.9. Гипотеза транспортирующих частиц
1.10. Гипотеза об участии аквапоринов в морфогенезе кремнистых панцирей диатомей
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
2.2. Выбор условий растворения панцирей диатомовых водорослей
2.3. Выделение суммарной белковой фракции после удаления кремнистых панцирей 5 М NH4F при pH 5
2.4. Последовательная экстракция белков из клеток диатомовых водорослей
2.5. Электрофорез в полиакриламидном геле с ДДС-Na
2.6. Использованные антисыворотки
2.7. Иммуноблоттинг
2.8. Иммунохроматография
2.9. Дот-блот анализ

2.10. Выделение ДНК
2.11. Подготовка библиотеки ДНК и пиросеквенирование
2.12. Аннотация гена sit
2.13. Оценка длины фрагментов трипсинового гидролиза белков диатомовых водорослей
2.14. Анализ аминокислотных последовательностей белков
2.15. Филогенетический анализ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Анализ аминокислотных последовательностей SIT, предсказанных по последовательностям нуклеотидов генов sit
3.2. Обнаружение белка SIT в протеоме S
subsp. radians и его выделение
3.3. Выявление и анализ гена sit! в геноме S. acus subsp. radians
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

ресуспендировали в 250 мМ Трис-НСІ, pH 8,8 и центрифугировали в тех же условиях. Промывку повторяли дважды. Затем осадок обрабатывали ультразвуком и проводили карбоксиметилирование 5 мМ йодуксусной кислотой в 250 мМ Трис-НС1, pH 8,8 в присутствии 3 мМ ФМСФ (1 ч, 4°С). Для разрушения дисульфидных связей и солюбилизации белков к осадку добавляли р-меркаптоэтанол до концентрации 52 мМ в 2 %-ном растворе ДДС-Иа в 250 тМ Трис-НС1, pH 8,8. Полученную суспензию инкубировали при постоянном перемешивании (12 ч, 37°С). Для защиты освободившихся меркапто-групп цистеина белок повторно карбоксиметилировали, добавляя йодуксус-ную кислоту до концентрации 54 мМ (1ч, 4°С). Смесь центрифугировали при 13 100 об./мин. (2 мин, 4°С), из супернатанта осаждали белки охлажденным метанолом в соотношении 1:4 (10 мин, 20°С). Осадок после центрифугирования растворяли в буфере (1% ДДС-Иа, 10% глицерин, 100 мМ |3-меркаптоэтанол, 50 мМ Трис-НС1, pH 6,8).
2.4. Последовательная экстракция белков из клеток диатомовых
водорослей
Для фракционирования белков из биомассы £. асгм была модифицирована описанная ранее методика последовательной обработки разными экстрагентами (Ргі§егі еі аі, 2006). Клетки в количестве 5-8 х 10б, концентрировали фильтрованием и промывали трижды в 4 мл буфера 10 мМ Трис-НС1 / 1 мМ СаСЬ, pH 7,4 (ТС-буфер). После последней промывки клетки переносили в ступку и растирали при 0°С в 4 мл ТС-буфером. Полученный гомогенат центрифугировали (2 мин, 16 100 об./мин, 4°С), супернатант переносили в отдельную пробирку - ТС-экстракт. Разрушенные клетки промывали пятикратно ТС-буфером и добавили 4 мл 100 мМ ЭДТА pH 7,8, инкубировали 12 ч при 4°С на качалке. Затем центрифугировали, как описано выше, и собирали супернатант - ЭДТА-экстракт.