Изучение процессов ремоделирования хроматина и репликации на инсуляторах D. melanogaster

• Автор: Мазина, Марина Юсуповна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

Обзор литератары

Глава 1. Хроматин

1.1. Структура и модификации гистонов

1.2. Классификации хроматина

Глава 2. Белковые комплексы, изменяющие структуру хроматина

2.1. Комплексы ремоделирования хроматина

2.1.1. Семейство SWI/SNF

2.1.2. Семейство ISWI
2.1.3. Семейство CHD
2.1.4. Семейство ENO
2.2. Комплексы, осуществляющие ковалентные модификации гистонов
2.2.1. Основные пострансляционные модификации хроматина
2.2.2. Гистонацетилтрансферазы (ГАТ)
2.2.3. Гистондеацетилазы (ГДА)
Г лава 3. Координация процессов репликации и транскрипции хроматина
Глава 4. Регуляторные элементы генома
4.1. Проксимальные и дистальные регуляторные элементы
4.2. Инсуляторы
4.2.1. Доменная организация генома
4.2.2. Энхансер-бпокирующие инсуляторы
4.2.2.1. Примеры энхансер-блокирующих инсуляторов
4.2.2.2. Модели функционирования энхансер-блокирующих инсуляторов
4.2.2.3. Роль инсуляторов в организации пространственной структуры ядра
4.2.2.4. Инсуляторы и эпигенетическое наследование признаков
4.2.2.5. Инсуляторы и импринтинг генетической информации
4.2.3 Барьерные инсуляторы
4.2.3.1. Примеры барьерных инсуляторов
4.2.3.2. Модели функционирования барьерных инсуляторов
Материалы и методы
1. Материалы
1.1. Штаммы и векторы E. coli, использованные в работе
1.2. Среды для культивирования E.coli, среда для культивирования S2 клеток
1.3. Ферменты и реактивы
1.4. Буферные растворы
1.5. Клеточные линии
1.6. Линии мух D. melanogaster
1.7. Антитела
1.8. Праймеры
1.9. Использованное программное обеспечение
2. Методы
2.1. Работа с E.coli. Клонирование плазмидных конструкций
2.2. Трансфекция эукариотических клеток
2.3. ПЦР; ПЦР в реальном времени (RT-PCR)
2.4. Выделение тотальной РНК из S2 клеток
2.5. Выделение геномной ДНК из S2 клеток
2.6. Получение кДНК
2.7. Получение двухцепочечной РНК
2.8. РНК-интерференция
2.9. Белковый гель-электрофорез
2.10. Westem-блот анализ
2.11. Иммунопреципитация (осаждение белков антителами)
2.12. Иммунопреципитация хроматина (СЫР)
Результаты
1. Su(Hw) привлекает комплекс SAGA на сайты связывания Su(Hw)
2. Su(Hw) привлекает комплекс dSWI/SNF на сайты связывания Su(Hw)
3. Su(Hw) необходим для формирования областей с низкой плотностью нуклеосом
4. Комплекс узнавания ориджинов репликации (ORC) привлекается на сайты связывания Su(Hw)
5. Cdc45 привлекается на пре-ретикативный комплекс на сайтах связывания Su(Hw)
6. Su(Hw)-ceH3hieaioinue сайты составляют значительную часть сайтов ORC в "синем" и "черном" типах хроматина
7. Рекрутирование комплексов SAGA, ВАР и ORC на сайты связывания Su(Hw) не зависит от типа окружающего хроматина
8. Искусственное привлечение Su(Hw) является достаточным для последующего рекрутирования комплексов SAGA, ВАР и ORC
9. Сайт связывания Su(Hw) определяет привлечение комплексов SAGA, ВАР и ORC..
10. Su(Hw), CTCF, GAF и BEAF32 обладают сходными свойствами ремоделирования хроматина и рекрутирования ORC
Обсуждение
Выводы
Список литературы

Список сокращений
Г АТ - гистонацетилтрансфераза
ГДА - гистондеацетилаза
п.о. - пар оснований.
т.п.о. - тысяч пар оснований.
BEAF (boundary-element associated factor) - белковый фактор, связывающийся с последовательностью инсулятора.
ChIP (chromatin iivtMunoprecipitation) - метод иммунопреципитации хроматина.
CTCF (CCCTC-binding factor) - фактор, связывающийся с последовательностью СССТС. CTD (С-terminal domain) - С-концевой домен РНК-полимеразы II.
DMR (differentially methylated region) - инсулятор в Igf2/H 19 локусе млекопитающих.
HAT (histone acetyltransferase) - гистонацетилаза.
НМТ (histone-methyltransferase) - гистонметилтрансфераза.
НР1 (heterochromatin protein 1) — негистоновый белок хроматина, участвующий в его компактизации.
HS (hypersensitive site) - области генома, гиперчувствительные к ДНКазе I.
hsp70 (heat-sbock protein 70) - локус генов D. melanogaster, активирующихся при тепловом
шоке.
ICR (imprinting choice region) - область, контролирующая импринтинг.
Igf2 (insulin-like growth factor 2) - ген инсулиноподобного фактора роста 2.
LCR (locus control region) - область контроля локуса.
ORC (origin recognition complex) - комплекс узнавания участков начала репликации.
PEV (position effect variegation) - эффект положения мозаичного типа.
PHD (Plant Homeo Domain) - гомеодомен растений.
Pol П (RNA polymerase II) - РНК-полимераза
SBP (ics-binding protein) - белок, связывающийся с последовательностью sc s.
Su(Hw) (suppressor of hairy wings ) - белок-супрессор ворсистых крыльев у D.melanogaster. TBP (TATA-binding protein) - ТАТА-связывающий белок.
Topors (topoisomerase-I-interacting protein) - топоизомеразо-1 -взаимодействующий белок. UAS (upstream activating sequense) - гщс-действующие регуляторные элементы.
USF (upstream transcriptional factor) - фактор, связывающий участок Н84-инсулятора.
Zw5 (Zeste-white 5) - ген zeste-white, кодирующий белок SBP.

Г лава 4. Регуляторные элементы генома
4.1. Проксимальные и дистальные регуляторные элементы
Проксимальные элементы промотора расположены в нескольких сотнях нуклеотидов перед коровым промотором и содержат сайты связывания для активаторов и репрессоров транскрипции. Дистальные регуляторные элементы (энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, LCR-элементы) могут находиться на расстоянии до нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов от промотора. Энхансеры впервые были обнаружены как участки генома вируса SV40, которые, находясь в составе вектора, несущего ген гемоглобина pi, значительно повышали уровень транскрипции последнего (Banerji et al., 1981). Было показано, что действие энхансера не зависит от положения и ориентации по отношению к сайту инициации транскрипции; расстояние до эффекторного гена может достигать 80 т.п.о. и более (Smale and Kadonaga, 2003). Функционирование энхансеров возможно благодаря их способности связывать белки, участвующие в активации транскрипции. Согласно идее «рекрутирования» активация промотора и сборка на нем преинициаторного комплекса происходит за счет действия факторов перестройки хроматина, привлекаемых к промотору связавшимся с энхансером активатором (Ptashne and Gann, 1997). Существует и альтернативная гипотеза, предполагающая, что сборка преинициаторного комплекса происходит на энхансере, результатом чего является инициация межгенной транскрипции РНК-полимеразой II (Orphanides et al., 1996).
Для объяснения механизма структурного взаимодействия энхансера с промотором на больших расстояниях на сегодняшний день предложено несколько моделей. •
- Модель выпетливания (looping model) (Рисунок 6а)
Взаимодействие энхансера и промотора происходит за счет выпетливания промежуточного участка хроматина (Ptashne, 1986). Поиск промотора комплексом энхансер-активатор может происходить за счет непрерывного сканирующего (scanning), либо скачкообразного (hooping) механизма (Bondarenko et al., 2003).
- Модель отслеживания (tracking model) (Рисунок 6в)
Было показано, что факторы активации транскрипции, специфически связывающие энхансер, могут быть обнаружены на спейсерной ДНК, отделяющей энхансер от промотора, причем только после связывания и активации этих факторов на энхансере (Hatzis and Talianidis, 2002). Модель отслеживания предполагает, что на энхансере происходит активация специфического белка, который после активации утрачивает контакт с энхансером и перемещается вдоль ДНК до встречи с транскрипционным комплексом на промоторе, запуская процесс