Особенности реакции расщепления РНК и регуляции активности у РНК-полимераз Deinococcus radiodurans, Thermus aquaticus и Thermus thermophilus

• Автор: Есюнина, Дарья Михайловна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 171 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Введение

1.2. Строение кор-фермента бактериальной РНКП

1.3. Механизмы инициации транскрипции

1.3.1. Формирование открытого промоторного комплекса

1.3.2. Структура промоторного комплекса

1.4. Механизмы элонгации транскрипции

1.4.1. Структура элонгационного комплекса
1.4.2. Реакции, катализируемые РНКП
1.4.3. Пути поступления нуклеотидов в активный центр РНКП
1.4.4.Структурные перестройки активного центра РНКП в ходе синтеза РНК..
1.4.4.1. Механизм включения нуклеотидов
1.4.4.2. Механизм транслокации РНКП
1.4.5. Механизмы, обеспечивающие высокую точность синтеза РНК
1.4.6. Обратное смещение РНКП и механизм расщепления РНК
1.4.7. Регуляции элонгации транскрипции с помощью транскрипционных
факторов
1.5. Терминация транскрипции
1.6. Белки бактериофагов, влияющие на функционирование РНКП
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Питательные среды и антибиотики
2.3. Компетентные клетки и трансформация бактерий
2.4. Манипуляции с ДНК
2.5. Получение промоторпых фрагментов ДНК и матрицы для измерения скорости элонгации
2.6. Получение генов, кодирующих белки GreA и мутантные РНКП E. coli и D. radio dur ans
2.7. Электрофорез белков и анализ взаимодействия белков в геле
2.8.0пределение концентрации белка
2.9. Выделение белков
2.9.1. Суперпродукция рекомбинантных белков
2.9.2. Выделение рекомбинантных РНКП E. coli, содержащих гистидиновый якорь (6His-tag)
2.9.3. Выделение рекомбинантных РНКП D. radiodurans и T. aquaticus, содержащих 6His-tag

2.9.4. Выделение РНКП из штамма E. coli с делецией Gre-факторов
2.9.5. Выделение РНКП из штамма Thermus thermophilus HB8rpoC::10H
2.9.6. Выделение белков GreA
2.9.7. Выделение ст-субъединицы и белка gp39 из тел включения
2.10. Электрофорез нуклеиновых кислот в денатурирующем геле
2.11. Транскрипция in vitro
2.11.1. Тест по синтезу полноразмерных РНК-продуктов
2.11.2. Тест по синтезу абортивных РНК-продуктов
2.11.3. Транскрипция на аптамерных матрицах
2.11.4. Определение кинетики диссоциации промоторных комплексов в присутствии гепарина
2.11.5. Получение искусственных элонгационных комплексов для исследования расщепления РНК
2.11.5.1. Тест по определению эффективности связывания каталитических ионов Mg2+ в активном центре РНКП
2.11.5.2. Тест по определению зависимости скорости расщепления РНК РНКП
от pH реакционного буфера
2.11.5.3. Тест по определению скорости расщепления РНК РНКП в присутствии белковых факторов
2.11.6. Определение скорости включения нуклеотидов в искусственных элонгационных комплексах
2.11.7. Определение скорости пирофосфоролиза
2.11.8. Измерение эффективности о-зависимой паузы с использованием искусственных ЭК
2.12. Определение влияния мутаций в РНКП на выживаемость клеток
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Исследование особенностей реакции расщепления РНК РНК-полимеразамн
D. radiodurans и E. coli
3.1.1 Оптимизация условий выделения РНКП для анализа реакции расщепления
3.1.2. Измерение скоростей синтеза РНК РНКП E. coli и D. radiodurans
3.1.3. Сравнение скоростей расщепления РНК РНКП E. coli и D. radiodurans и
поиск различий в протекании данной реакции
3.1.4. Поиск районов, определяющих межвидовые различия в реакции расщепления РНК РНКП E. coli и D. radiodurans
3.1.5. Исследование влияния мутаций в G-петле на выживаемость клеток
3.1.6. Исследование делений G-петли в РНКП E. coli и D. radiodurans
3.1.7. Изучение влияния факторов GreA на реакцию расщепления РНК РНК-полимеразами E. coli и D. radiodurans и их мутантными вариантами
3.2. Исследование особенностей реакции расщепления РНК РНКП Т. aquaticus
по сравнению с РНКП D. radiodurans
3.2.1. Анализ структурных элементов РНКП, определяющих различия в скорости расщепления РНК РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans
3.2.2. Влияние Gre-факторов на расщепление РНК мутантными вариантами РНКП
Т. aquaticus

3.3 Механизмы регуляции транскрипции РНК-полимеразы Т. thermophilus белком gp39 бактериофага Р
3.3.1. Анализ влияния белка gp39 бактериофага Р23-45 на инициацию транскрипции на разных промоторах
3.3.2. Поиск сайта связывания белка gp
3.3.3. Анализ механизма подавления инициации транскрипции белком gp39 фага Р
3.3.4. Влияние белка gp39 на элонгацию транскрипции
3.3.5. Механизм действия белка gp39 на терминацию транскрипции.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ

присоединен к З'-концу РНК. Однако стоит помнить, что после катализа З'-конец РНК находится в инсерционном сайте, поэтому для включения следующего нуклеотида должна произойти транслокация РНКП.
1.4.4.2. Механизм транслокации РНКП
Транслокация - это двустадийный процесс (Brueckner and Cramer, 2008), основную роль в котором играют изменения конформации F-спирали (см. рисунок 1.8). Во время первой стадии транслокации РНК-ДНК гибрид перемещается из претранслокационного состояния (З'-конец РНК занимает i+1 сайт) в посттранслокационное (З'-конец РНК занимает /-сайт). В это же время передний ДНК-дуплекс расплавляется на 1 нуклеотид и входит внутрь РНКП, обеспечивая попадание следующего нуклеотида ДНК (+2) в «прематричное» положение (pretemplating) (см. рисунок 1.8 Б, начальное состояние процесса 3). Сразу после синтеза фосфодиэфирной связи F-спираль полностью выпрямлена (Gnatt et al., 2001). Первая стадия транслокации обеспечивается изгибанием F-спирали в сторону РНК-ДНК гибрида. Остатки Thrl088 и А1а1089 (нумерация для Т. thermophilus) при этом взаимодействуют с азотистым основанием нуклеотидного остатка в -1 положении матричной цепи ДНК, а остаток G-петли Metl238 (нумерация Т. thermophilus) вклинивается в формирующийся изгиб F-спирали (Brueckner and Cramer, 2008). Это приводит к дальнейшему смещению F-спирали в сторону i-сайта активного центра и к перемещению З'-конца РНК из i+1 в /-сайт. Это состояние стабилизируется заклиненной конформацией G-петли, которая наблюдается на структуре дрожжевой РНКП II в комплексе с а-аманитином (Brueckner and Cramer, 2008) (см. рисунок 1.8 Б).
На второй стадии транслокации F-спираль выпрямляется и возвращается в исходное состояние, а G-петля переходит в открытое состояние. Основным событием второй стадии транслокации является переход следующего нуклеотидного остатка матричной цепи ДНК в i+1 сайт активного центра, что необходимо для дальнейшего связывания нового входящего нуклеотида (Kettenberger et al., 2004). Это обеспечивается изменением положения азотистого основания на 90° (Brueckner and Cramer, 2008). Вторая стадия транслокации также сопровождается дополнительным изменением положения переднего дуплекса ДНК и изменением конформации фосфата между +1 и +2 нуклеотидами матричной цепи ДНК (Brueckner and Cramer, 2008). В итоге всех описанных выше перестроек РНКП оказывается готова к присоединению следующего нуклеотида.
Важно отметить, что детальная расшифровка всех структурных перестроек, происходящих при транслокации, не дает ответа на вопрос, за счет чего обеспечивается