Исследование механизмов действия монооксида углерода и УФ-света на структурно-функциональное состояние лимфоцитов и эритроцитов крови человека

• Автор: Тюнина, Ольга Ивановна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 174 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурно-функциональная характеристика клеток крови человека

1.1.1. Характеристика лимфоцитов крови человека, особенности их строения и метаболизма
1.1.2. Характеристика эритроцитов крови человека, особенности их строения и метаболизма

1.2. Апоптоз: морфологические особенности и молекулярные механизмы

1.2.1. Структура, физико-химические свойства и функции

СБ95 (Газ/АРО-1) рецепторов
1.2.2. Регуляция апоптоза антиапоптозными белками и цитокинами
1.3. Краткая характеристика УФ-излучения и его воздействие на
клетки крови человека
1.4. Монооксид углерода - внутриклеточный газовый посредник 44 Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение лимфоцитов из крови доноров методом седиментации в градиенте плотности фиколл-урографина
2.2.2. Выделение эритроцитов из гепаринизированной крови доноров
2.2.3. Генерация монооксида углерода лабораторным методом
2.2.4. Определение концентрации монооксида углерода в эксперименте
2.2.5. Определение активности ионов водорода (pH) буферного раствора Хенкса в процессе инкубации нативных и СО-модифицированных лимфоцитов крови человека
2.2.6. Облучение УФ-светом суспензии лимфоцитов крови человека
2.2.7. Модификация лимфоцитов крови человека блокаторами синтеза
белка (циклогексимидом и анизомицином) и рекомбинантным интерлейкином-
2.2.8. Исследование жизнеспособности лимфоцитов крови человека
2.2.9. Исследование уровня экспрессии некоторых мембранных маркеров на поверхности лимфоцитов крови человека методом иммуноферментного анализа
2.2.10. Исследование уровня экспрессии СБ95 рецептора на поверхности мембран лимфоцитов крови человека методом проточной цитофлуориметрии
2.2.11. Исследование поверхностной архитектоники эритроцитов крови человека
2.2.12. Выделение ДНК из лимфоцитов крови человека
2.2.13. Анализ образцов ДНК с помощью метода горизонтального электрофореза в геле
2.2.14. Исследование люминолзависимой хемилюминесценции лимфоцитов крови человека
2.2.15. Выделение митохондрий из лимфоцитов крови человека
2.2.16. Определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в митохондриях лимфоцитов крови человека
2.2.17. Определение активности цитохром с оксидазы в митохондриях лимфоцитов крови человека
2.2.18. Приготовление гемолизатов эритроцитов крови человека по методу Драбкина
2.2.19. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в гемолизате эритроцитов крови человека
2.2.20. Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ пр. и ЛДГ обр.) в гемолизате эритроцитов крови человека и расчет коэффициента баланса энергетических реакций
2.2.21. Определение содержания антиапоптозного белка Вс1-2 в лизате лимфоцитов крови человека

2.2.22. Определение содержания антиапоптозного белка сурвивина в лизате лимфоцитов крови человека
2.2.23. Статистическая обработка результатов
Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ МОНООКСИДА УГЛЕРОДА НА ЛИМФОЦИТЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
3.1. Определение жизнеспособности СО-модифицированных (5+90 мин.) лимфоцитов крови человека до и после суточного термостатирования
3.2. Исследование влияния монооксида углерода (5+90 мин.) на изменение активности ионов водорода (pH) в растворе Хенкса лимфоцитов крови человека
3.3. Исследование влияния монооксида углерода (5+90 мин.) на уровень экспрессии CD95 рецепторов лимфоцитов крови человека методом иммуноферментного анализа
3.3.1. Изучение влияния блокаторов синтеза белка на уровень экспрессии CD95 рецептора СО-модифицированных лимфоцитов крови человека
3.4. Исследование влияния монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) на уровень экспрессии CD95 рецепторов лимфоцитов крови человека методом проточной цитофлуориметрии
3.5. Исследование влияния монооксида углерода (5+90 мин.) на уровень экспрессии CD8 рецепторов лимфоцитов крови человека методом иммуноферментного анализа до и после суточного термостатирования
3.6. Исследование структурного состояния молекул ДНК лимфоцитов крови человека после воздействия монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) до и после суточного термостатирования
3.7. Исследование люминолзависимой биохемилюминесценции лимфоцитов крови человека после воздействия монооксида углерода (60, 75 и 90 мин.) до и после их суточного термостатирования
3.8. Исследование активности митохондриальной сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов крови человека после воздействия монооксида углерода

при образовании гетеродимеров Bax-Bcl-2 (R.T. Aliena, M.W. Cluckb, D.K. Agrawal, 1998; Т. Ohtsuka, Н. Ryu, Y.A. Minamishima et al., 2004).
Семейство генов Bcl-2 локализовано у человека на хромосоме 18. Восприятие анти- или проапоптотических сигналов Вс1-2 осуществляется как на уровне генов (так, транскрипционный фактор р53 повышает экспрессию гена Вах), так и на уровне посттрансляционной модификации белков (действие цитокинов). Про-и антиапоптотическое действие активированных белков семейства Вс1-2 реализуется главным образом через модуляцию активности митохондрий.
Каспаза-8 активирует каспазы второго эшелона: в результате протеолиза из прокаспазы-3 образуется каспаза-3, и процесс гибели клетки после этого становится необратимым. Каспаза-3 способна в дальнейшем к самостоятельной активации, способствует активации ряда других протеаз семейства каспаз, факторов фрагментации ДНК, что приводит к необратимому распаду ДНК на нуклеосомные фрагменты. Такой тип передачи сигнала может наблюдаться, например, у лимфоидных клеток.
Ограничение гибели клетки может происходить с участием белков семейства IAP, которые ингибируют каспазы (C. Adrain, Е.А. Slee, М.Т. Harte, S.J. Martin, 1999; М. Holcik, R.G. Korneluk, 2001; М. Leist, М. Jaattela, 2001; S.P. Hessain,
C.C. Harris, 2006). Ha N-конце все IAP-белки имеют от 1 до 3 специфических повторов, называемых BIRs (примерно по 70 аминокислот в каждом). Белок сурви-вин (survivin) является одним из представителей семейства IAP-белков, участвующий в ингибировании каспаз. Его экспрессия значительно увеличивается в опухолевых клетках. Обнаружено несколько изоформ сурвивина, образующихся в результате альтернативного сплайсинга (H. Caldas, Y. Jiang, М.Р. Holloway et al., 2005). Белок сурвивин — член семейства IAP белков, участвующий в контроле клеточного деления, регуляции апоптоза, ангиогенеза (R.A. Altura, R.S.Olshevski,
D.B. Boue, 2000). Антиапоптотическая функция заключается в прямом или опосредованном ингибировании каспаз, например, за счет связывания сурвивина с белком SMAC (Second Mitohondria-derived Activator of Caspase). Smac/DIABLO -белок с молекулярной массой 25 кД, высвобождающийся из митохондрий в цито-