Дифференциация гемагглютининов H5 и H7 вируса гриппа A птиц на основе моноклональных антител

• Автор: Жиангерова, Ольга Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 163 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
Оглавление
Список сокращений
Аннотация
1. Введение
1.1. Актуальность темы
1.2. Цель и задачи исследований
1.3. Научная новизна работы
1.4. Практическая значимость результатов
1.5. Апробация и публикация результатов
1.6. Основные положения, выносимые на защиту
1.7. Благодарности
2. Обзор литературы
2.1. История изучения вируса гриппа
2.2. Морфологическая и биохимическая характеристики семейства ОПотЬсоутйае
2.2.1. Организация генома и репликация
2.2.2 Патогенез, клинические признаки и патоморфологические изменения
2.3 Диагностика гриппа птиц
2.4. Получение моноклональных антител
2.5. Использование МКА для изучения и диагностики гриппа
2.6. Заключение по обзору литературы
3. Собственные исследования
3.1. Материалы
3.1.1. Вирусы
3.1.2. Животные
3.1.3. Культуры клеток
3.1.4. Питательные среды и добавки к ним
3.1.5. Сыворотки
3.1.6. Белки и ферменты
3.1.7. Хроматографические сорбенты и гелеобразующие среды
3.1.8. Кислоты и основания

3.1.10. Растворители
3.1.11. Красители и хромогенные субстраты
3.1.12. Детергенты
3.1.13. Реактивы
3.1.14. Исходные водные растворы
3.1.15. Оборудование
3.2. Методы
3.2.1. Получение вируссодержащего материала и определение его инфекционной активности
3.2.2. Определение концентрации белка
3.2.3. Получение гибридом
3.2.4. Скрининг гибридных антителопродуцентов
Скрининг в реакции торможения гемагглютинациии (РТГА)
Скрининг микровариантом реакции нейтрализации

Оглавление
3.2.5. Клонирование миелом и гибридных антителопродуцентов
3.2.6. Изучение иммунохимических свойств МКА
3.2.7. Криоконсервирование клеток
3.2.8. Восстановление гибридом после хранения
3.2.9. Получение иммуноасцитических жидкостей
3.2.10. Очистка в моноклональных антител из асцитических жидкостей
3.2.11. Конъюгирование моноклональных антител с пероксидазой хрепа
3.2.12. Скрининг методом непрямого ингибирования ТФ ИФА
3.2.14. Разработка методов выявления антигенных детерминант гемагглютинина Н5 и Н7 вируса гриппа птиц
3.2.15. Методы математического анализа
3.3. Результаты
3.3.1. Изготовление антигенсодержащих препаратов
3.3.2. Определение оптимальных параметров методов скрининга моноклональных антител, специфичных к антигенным детерминантам гемагглютинина Н5 и Н7 вируса гриппа птиц
3.3.2.1. Определение оптимальных параметров непрямого метода твердофазного иммуноферментного анализа для скрининга гибридных антителопродуцентов
3.3.2.2. Определение оптимальных параметров непрямого метода иммуногистохимического анализа для скрининга гибридных антителопродуцентов
3.3.3. Получение гибридом, секретирующих моноклональные антитела, специфичные к антигенным детерминантам гемагглютинина Н5 и Н7 вируса гриппа птиц
3.3.3.1. Отработка схемы иммунизации мышей ВАЬВ/с-доноров сенсибилизированных В-лимфоцитов
3.3.3.2. Получение гибридом
3.3.4. Клонирование гибридных клеток
3.3.5. Скрининг МКА непрямым методом ИГХ ИФА
3.3.6. Изучение иммунохимических свойств полученных моноклональных антител
3.3.6.1. Определение класса и подкласса МКА
3.3.6.2. Изучение активности полученных МКА в непрямом варианте ТФ ИФА
3.3.6.3. Изучение антигемагглютинирующих свойств полученных МКА
3.3.6.4. Изучение свойств полученных МКА методом ингибирования ТФ ИФА
3.3.6.5. Изучение вируснейтрализующих свойств полученных МКА
3.3.7. Изготовление и контроль конъюгатов МКА с пероксидазой
хрена
3.3.8. Отработка оптимальных условий постановки иммуногистохимического метода ТФ ИФА на основе моноклональных антител для обнаружения и дифференциации антигенных детерминант гемагглютинина Н5 и Н7 вируса гриппа птиц

Оглавление
3.3.9. Определение эпитопной специфичности моноклональных антител, специфичных к антигенным детерминантам гемагглютинина Н5 и Н7 вируса гриппа птиц
3.3.10. Определение полипептидной специфичности полученных моноклональных антител
3.3.11. Отработка оптимальных условий постановки «сэндвич»-варианта твердофазного иммунофермеитного анализа на основе моноклональных антител для обнаружения и дифференциации антигенных детерминант гемагглютинина Н5 и Н7 вируса гриппа птиц
3.3.11.1. Определение оптимального варианта сочетания моноклональных реагентов при постановке двухсайтового “сэндвич” - варианта ТФ ИФА
3.3.11.2. Изучение чувствительности и специфичности сэндвич-варианта ТФ ИФА, на основе специфичных моноклональных антител для выявления антигенных детерминант гемагглютининов 5 и 7 подтипов в экстраэмбриональной жидкости куриных эмбрионов
и пробах органов птиц, инфицированных вирусом гриппа птиц
3.3.12. Серологический мониторинг гриппа птиц среди домашней, дикой и синантропной птицы
4. Обсуждение
5. Выводы
6. Практические предложения
7. Список использованной литературы
8. Приложение

Собственные исследования
Материалы и методы

• Мыши белые беспородные, массой 20-30 г.
• Петухи породы Леггорн массой 2,5-3 кг.
Клинически здоровых животных получали из питомников «Столбовая», «Светлые горы» РАМЫ и сектора подготовки подопытных животных ГНУ ВНИИВ-ВиМ. СПФ эмрионы кур получали из Щелковского биокомбината. До начала проведения экспериментов за клиническим состоянием животных наблюдали в течение 10-14 дней. Кормление осуществляли в соответствии с рекомендуемыми рационами. В исследованиях использовали только клинически здоровых животных.
3.1.3. Культуры клеток.
Для культивирования вирусов и приготовления антигенов использовали пере-виваемые культуры клеток:
• почки собаки (спаниэля) - (MDCK), катал.№ 32 (каталог ГНУ ВНИИВВиМ),
• полусуспензионная линия клеток мастоцистомы мыши (Р815),
• почки сибирского горного козерога (ПСГК), катал .№ 25 (каталог ГНУ ВНИИВВиМ).
Культуры клеток получали в лаборатории «Биология и культивирование вирусов» и «Культуры клеток с музеем клеточных штаммов» ГНУ ВНИИВВиМ.
В качестве партнера для слияния при получении гибридом использовали дефектную по ГГФРТ миеломную линию клеток Sp 2/0 - Ag 14.1 (Sp 2/0).
3.1.4. Питательные среды и добавки к ним.
• Среда Игла МЕМ;
• среда DMEM, сухая, без бикарбоната натрия (фирма "Sigma", США);
• бикарбонат натрия ("Sigma", США);
• 10000 Ед пенициллина, 10 мг стрептомицина, 25 мкг амфотерицина в составе "Antibiotic antimicotic solution (100Х) Hybri-Max" ("Sigma", США);
• раствор гентамицина (40 мг/см3);
• среду DMEM готовили путем растворения сухого компонента в указанном на упаковке количестве бидистиллированной воды (сопр. >7 МОм) и добавления бикарбоната натрия ("Sigma", США) до конечной концентрации 3.2 г/дм3 со-