Влияние ненативных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы на функционирование шаперонина GroEL

• Автор: Полякова, Оксана Валентиновна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
МЕХАНИЗМ СВОРАЧИВАНИЯ БЕЛКОВ И ВЛИЯНИЕ
ШАПЕРОНОВ НА ЭТОТ ПРОЦЕСС
СЕМЕЙСТВО ШАПЕРОНИНОВ/Hsp
Структура шаперонина
Структура кошаперонина
Механизм сворачивания белков при участии GroEL-GroES
системы
Взаимодействие полипептидов с шаперонином
Константы связывания белков с шаперонином
Конформационные изменения в структуре белка при его
взаимодействии с шаперонином
Значение связывания и гидролиза АТР в реакционном цикле
системы шаперонина
Третичный комплекс GroEL-GroES-полипептид
Значение центральной полости шаперонина в сворачивании
белков
Высвобождение ненативных форм белка из комплекса
GroEL-GroES
Взаимодействие шаперонина с большими и олигомерными
белками
Новые функции шаперонина GroEL
D-ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА
Общая характеристика фермента
Термостабильная ГАФД Bacillus stearothermophilus
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Методы выделения белков
Аналитические методы
Метод иммобилизации
Получение иммобилизованных форм ГАФД различной
нативности и степени олигомерности
Электрофорез белков в ПААГ
Иммуноблотгинг
Модификация SH-групп ГАФД из мышц кролика
5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислотой
Измерение АТФазной активности GroEL

Определение коэффициента седиментации
Дифференциальная сканирующая калориметрия
Регистрация спектров кругового дихроизма
Денатурация ГАФД
Исследование рефолдинга ГАФД В..?/
Процедура инкубации иммобилизованных белков с
растворимыми партнерами реакции
Получение и очистка антител
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Выделение и характеристика шаперонина СгоЕЬ
2. Взаимодействие СгоЕЬ с модифицированной ГАФДдТНб
2.1. Модификация 8Н-групп ГАФД из мышц кролика с
помощью ДТНБ
2.2. Взаимодействие ОгоЕЬ с модифицированной ГАФД из мышц кролика
2.3. Определение параметров связывания ОгоЕЬ с иммобилизованной ГАФДдтнб
3. Взаимодействие СгоЕ1. с мутантными димерами термостабильной ГАФД В.М
3.1. Характеристика мутантных димеров термостабильной ГАФДВ.х?
3.2. Взаимодействие ОгоЕЬ с мутантными димерами термостабильной ГАФД В.зТ
3.3. Исследование взаимодействия ОгоЕЕ с О-й-димерами в растворе методом нативного электрофореза
3.4. Получение высокоспецифичных поликлональных
антител к ОгоЕЬ и термостабильной ГАФД Вм
3.5. Анализ комплекса СгоЕЬ-О-й-димер в растворе методом нативного электрофореза и последующего иммуноблоттинга
3.6. Анализ комплекса ОгоЕЬ-О-й-димер в растворе при помощи метода иммунопреципитации
4. Влияние модифицированной ГАФДщтнб и мутантных О-Я-димеров на СгоЕЬ-зависимый рефолдинг денатурированной термостабильной Г АФД
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ААТ - аспартатаминотрансфераза
АНС - аминонафталиносульфонат
ГАФД - D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа
ГАФД B.st. - ГАФД Bacillus stearothermophilus
ГАФДдтнб - Г АФД, модифицированная ДТНБ
ДГФР - дегидрофолатредуктаза
дсн - додецил сульфат натрия
ДТНБ - 5,5'-дитиобис-2- нитробензойная кислота
ДТТ - дитиотреитол
КД - круговой дихроизм
ЛДГ - лактатдегидрогеназа
мдг - малатдегидрогеназа
МСБ - мальтозо-связывающий белок
ОТК - орнитинтранскарбомоилаза
ПААГ - полиакриламидный гель
ТСБ - трис-солевой буфер
ФГА - фосфоглицериновый альдегид
ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
декарбоксилазы El (компонента дегидрогеназного комплекса а-кетокислот), экспрессированного в клетках E.coli (Huang and Chuang, 1999). Было доказано образование бинарного комплекса МСБ-ct-GroEL в лизате трансформированных клеток и увеличение на порядок константы скорости сворачивания полипептида в присутствии шаперонина относительно его спонтанного фолдинга. Также было обнаружено, что при инкубации комплекса в присутствии GroES происходит образование только транс-комплекса, что подтверждает предположение о том, что продуктивный фолдинг больших мультидоменных белков может происходить в центральном канале шаперонина, не ограниченного GroES. В других исследованиях было показано, что GroEL-зависимый фолдинг 72 кДа белка фага Р 22 не требует кошаперонина, при этом также возможно образование гран-комплекса. Очень интересные данные о характере взаимодействия шаперонина с олигомерными белками были получены при исследовании влияния GroEL на фолдинг дегидрогеназы а-кетокислот с разветвленной цепью (Song et al., 2000). Было показано, что связывание интермедиата сф-гетеродимер с GroEL-GroES является необходимым для образования нативного агРг комплекса, и подробно охарактеризовано влияние шаперонина на этот процесс. Инкубация комплекса GroEL-сф-гетеродимер с Mg-ATP приводит к высвобождению а-субьединицы. Высвобождение Р-субъдиницы также происходит, но при этом она не способна ассоциировать с а-субъединицей и сразу же повторно связывается с шаперонином. При инкубации комплекса GroEL-aP-гетеродимер с Mg-ATP и GroES происходит высвобождение обоих типов субъединиц. При этом Р-субьединица взаимодействует снова с шаперонином, где в цис-комплексе GroEL-GroES происходит ее эффективный фолдинг. Далее происходит высвобождение р-субъединицы и формирование правильного гетеродимера.