Визуализация комплексов белок-белок в цитохром Р-450-содержащих системах

• Автор: Кузнецов, Вадим Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
Часть 1. Введение
Часть 2. Обзор литературы.
Глава 2.1. Молекулярная организация систем цитохромов Р450.
2.1.1. Система цитохрома Р450 cam.
2.1.2. Система цитохрома Р450 2В4
2.1.3. Система цитохрома Р450 see
2.1.4. Цитохром Р450 52АЗ 29 Глава 2.2. Метод сканирующей зондовой микроскопии. Приложение
к биообъектам.
2.2.1. Общие принципы.
2.2.2. Сканирующая туннельная микроскопия.
2.2.3. Атомно-силовая микроскопия.
Контактный режим ACM
Полуконтактный режим ACM
2.2.4. Иглы-зонды для СЗМ
2.2.5. Применение методов СЗМ для визуализации биообъектов 43 Часть 3. Экспериментальная часть.
Глава 3.1. Материалы и методы.
Глава 3.2. Результаты и их обсуждение.
3.2.1. Визуализация молекул методом сканирующей туннельной микроскопии.
3.2.2. Визуализация молекул и их комплексов методом атомносиловой микроскопии.
Система цитохрома Р450 cam
Система цитохрома Р450 2В4
Система цитохрома Р450 see
Цитохром Р450 52АЗ
Часть 4. Выводы
Часть 5. Список литературы
Благодарности

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
Р450 - цитохром Р
d-2B4 - полноразмерный цитохром Р450 2В4 t-2B4 - трункированный цитохром Р450 2В
d-Fp - полноразмерная NADPH-зависимая цитохром Р450-редуктаза
t-Fp - трункированная NADPH-зависимая цитохром Р450-редуктаза
d-b5 - полноразмерный цитохром Ь
t-b5-трункированный цитохром Ь
P450scc -цитохром P450scc
Ad - адренодоксин
AdR - адренодоксин-редуктаза
P450cam -цитохром P450cam
Pd - путидаредоксин
PdR - путидаредоксин-редуктаза
52АЗ - цитохром Р450 52АЗ
d-52A3 - полноразмерный цитохром Р450 52АЗ
t-52A3 - трункированный цитохром Р450 52АЗ
FAD - флавинадениндинуклеотид
FMN - флавинмононуклеотид
NADPH - никотинамиддинуклеотидфосфат восстановленный
NADH - никотинамиддинукпеотид восстановленный
ACM - атомно-силовая микроскопия
ВОПГ - высокоориентированный пиролитический графит
РСА - рентгено-структурный анализ
СЗМ - сканирующая зондовая микроскопия
СТМ - сканирующая туннельная микроскопия
ТРИС - трис(гидроксиметил)аминометан
ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

ЧАСТЬ 1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность
Актуальность изучения цитохром Р450-содержащих систем обусловлена их важной ролью в природе, так как эти системы ответственны за протекание ключевых биологических реакций, в которых участвуют посредством белок-белковых взаимодействий (Archakov and Bachmanova, 1990). Можно условно выделить, во-первых, цитохром Р-450-содержащие системы, участвующие в окислении экзогенных веществ, превращающие их, таким образом, в более полярные соединения и, способствуя тем самым облегченному их выведению из организма путём фильтрации. Во-вторых, цитохром P-450-содержащие системы участвуют в метаболизме широкого круга эндогенных субстратов, например, осуществляя синтез прегненолона из холестерина.
По своей локализации относительно цитоплазматической мембраны монооксигеназные системы цитохрома Р450 делятся на три типа. К первому типу относятся монооксигеназные системы, целиком состоящие из водорастворимых цитозольных белков. Типичным представителем данной группы является цитохром Р450 101 (Р-450сат) из бактерий Pseudomonas putida. Этот фермент взаимодействует с путидаредоксином (Pd), а тот, в свою очередь, с путидаредоксин-редуктазой (PdR) (Gunzalus, 1969, Gunzalus et al, 1971).
Другим типом организации белков редокс-партнёров в системе Р-450 является микросомальная монооксигеназная система. В этом случае все три белка, участвующие в переносе электрона, локализованы в мембране и имеют соответствующие участки связывания в своей структуре. Цитохром Р-450 2В4 - типичный представитель такого типа систем. Вместе с ним в систему входят NADPH-специфический флавопротеин (Fp) и цитохром Ь5 (Ь5) (Archakov et al., 1973, Archakov et al., 1979).
Промежуточный тип организации системы представлен митохондриальной гидроксилазной системой. Два белка этой системы -адренодоксин редуктаза (AdR) и адренодоксин (Ad) находятся в

зондом и образцом. Получившаяся схема и является атомно-силовым микроскопом. В зависимости от природы регистрируемого сигнала взаимодействия выделяют различные режимы ACM.
Контактный режим ACM.
Первые атомно-силовые микроскопы работали именно в режиме контактного взаимодействия. Так, первый атомно-силовой микроскоп, созданный в 1986 г. Г.Биннигом (Binnig, 1986), работал именно так. Игла, подводящаяся с помощью пьезосканера к поверхности образца, при приближении на достаточно малое расстояние начинает притягиваться за счет сил Ван-дер-Ваальса. Затем, когда при продолжающемся приближении к поверхности начинает нарастать сила отталкивания, растёт искривление балки кантилевера, что может быть зарегистрировано.
В первых конструкциях атомно-силовых микроскопов в качестве датчика изгиба балки использовался фактически атомно-силовой микроскоп, регистрирующий изменение расстояния между собственной иглой и поверхностью кантилевера. Вскоре были предложены альтернативные методы регистрации вертикальных перемещений конца балки, среди которых использование емкостных датчиков (Neubauer, 1989), интерферометры (McCellend, 1987), оптические схемы (Heinzeimann, 1987). Затем была предложена схема регистрации отклонений плоскости балки с помощью фотодиода и лазерного луча. Кроме простоты исполнения, этот вариант позволял регистрировать изгибы балки кантилевера сразу в двух плоскостях, т.е. нормальную составляющую и крутильную деформацию. Последнее, как будет следовать из дальнейшего, позволяет получать ценную информацию, реализуя дополнительные режимы работы ACM.
Таким образом, возможна регистрация силы взаимодействия между острием иглы-зонда и поверхностью. Дополнительно возможные режимы контактной микроскопии заключаются в следующем:
Измерение латеральных сил - заключается в измерении крутильной деформации зонда - см. ниже.