Сравнительное исследование механизмов взаимодействия цитохрома Р450 2В4 и гемового домена монооксигеназы Р450ВМ3 с их партнерами-донорами электронов

• Автор: Карякин, Андрей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
I. Введение
II. Обзор литературы
2.1. Р450-содержащие монооксигеназные системы
2.1.1. Состав и локализация монооксигеназных систем
2.1.2. Бактериальная монооксигеназа ВМЗ из В. megaterium
2.1.2.1. Редуктазный домен
2.1.2.2. Гемовый домен
2.1.3. Микросомальная монооксигеназа
2.1.3.1. ИАОРН-цитохром Р450 редуктаза
2.1.3.2. Цитохром Р450
2.2. Белок-белковые взаимодействия в монооксигеназных системах
2.2.1. Роль заряженных аминокислотных остатков в межмолекулярных взаимодействиях компонентов ММО
2.2.2. Роль заряженных аминокислотных остатков в междоменовых взаимодействиях компонентов бактериальной монооксигеназы ВМЗ
2.3. Теоретический анализ описания электростатических взаимодействий
2.4. Применение метода инфракрасной спектроскопии для изучения структуры белков и их комплексов
5. Методы регистрации белок-белковых взаимодействий
III. Материалы и методы
3.1 Реактивы, реагенты и ферменты
3.2 Аналитические методы
3.3 Кинетические методы
3.4 Метод химической модификации
3.5 Регистрация образования комплексов цитохром Р450-редуктаза методом резонансного переноса энергии
3.6. Метод инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье
IV. Результаты
4.1. Сравнительное исследование взаимодействий редокс партнеров ММО и бактериальной монооксигеназы ВМЗ различными методами
4.2. Исследование влияния электростатических сил на процессы образования

комплексов цитохромов Р450 2В4 и ВМР с ЫСРИсрм и ВМЗсрм
4.3. Применение модели «параллельные поверхности» для описания зависимостей Ка комплексов 2В4-ЫСРК, 2В4-ВМЯ, ВМР-ВМ11 и ВМР-ЫСРЯ от ионной силы среды
4.4. Восстановление цитохромов Р450 чужеродными редуктазами: гемового домена ВМР микросомальной 1ЧСР11 и 2В4 бактериальной редуктазой ВМЯ.
4.5. Применение ИК-спектроскопии для исследования конформационных переходов в гемовом и РМЫ-содержащем доменах бактериальной монооксигеназы ВМЗ при их комплексообразовании
4.5.1. Определение изменения процентного содержания вторичных структур ВМР и РМИО при комплексообразовании путем описания ИК-спектров функциями Гаусса
4.5.2. Определение структурных изменений в молекулах ВМР и РМЫО при комплексообразовании путем титрования РМЫБ гемовым доменом и анализа данных методом главных компонент
V. Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы

Список сокращений.
2В4 Цитохром P450 2B
ВМЗ Бактериальная монооксигеназа ВМЗ из Bacillus megaterium
BMP Гемовый домен бактериальной монооксигеназы ВМЗ
BMR Редуктазный домен бактериальной монооксигеназы ВМЗ
CPM 7-этиламино-3-(4’-малеимидилфенил)-4-метилкумарин
FAD Флавинадениндинуклеотид
FMN Флавинмононуклеотид
FMND FMN-содержащий домен бактериальной монооксигеназы ВМЗ
FNR Ферредоксин NADP+ редуктаза
MOC Монооксигеназная система
NADP Никотинамидадениндинуклеотид фосфат
NADPH Восстановленный никотинамидадениндинуклеотид фосфат
NCPR NADPH-цитохром Р450 редуктаза
ДТТ Дитиотреитол
ИКПФ Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье
MPC Монооксигеназная растворимая система
ОСПВС отдельные спектры поглощения вторичных структур
РПЭФ резонансный перенос энергии флуоресценции

липидном бислое, процессов денатурации белков и конформационных изменений [15, 16, 44, 110], так и для исследования белок-белковых взаимодействий [168].
Взаимодействие молекул можно регистрировать по зависимым от концентрации комплекса изменениям спектров флуоресценции, времени жизни или поляризации флуоресценции растворов белков. Метод резонансного переноса энергии основан на переносе энергии между молекулой флуорофора, находящейся в возбужденном состоянии (донор) и молекулой флуорофора, находящейся в основном состоянии (акцептор) [42]. Такой перенос энергии называется резонансным, поскольку частота, соответствующая переходу молекулы донора из возбужденного состояния в основное, совпадает с частотой, соответствующей обратному процессу в молекуле акцептора. Для осуществления резонансного переноса энергии необходимо соблюдение ряда условий: а) время жизни молекулы донора в возбужденном состоянии должно быть достаточно большим; б) спектр поглощения молекулы акцептора должен перекрываться со спектром флуоресценции молекулы донора; в) пространственная ориентация молекул донора и акцептора должна быть таковой, чтобы обеспечивать между ними достаточно сильное взаимодействие; г) молекулы донора и акцептора должны располагаться друг от друга на расстоянии, достаточно близком, чтобы мог осуществляться перенос энергии [ив].
При изучении белок-белковых взаимодействий методом резонансного переноса энергии используются два подхода. В одном случае осуществляется перенос энергии между двумя флуорофорами с появлением индуцированной флуоресценции. В другом случае, если один из белков несет на себе хромофор, поглощающий в области флуоресценции флуорофора, расположенного на другом белке, то за процессом взаимодействия можно следить по уменьшению интенсивности флуоресценции флуорофора в результате образования комплекса между такими белками.
Еще одним параметром, позволяющим регистрировать образование комплекса, является степень поляризации флуоресценции. Одним из достоинств такого подхода является то, что этот показатель прямо зависит от скорости вращательной диффузии флуорофора и, следовательно, несет информацию о размере флуоресцирующей частицы. Образование комплекса приводит к