Разработка и экспериментальное обоснование клинического применения комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Орлова, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 233 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Ад- аденозин
АК - арахидоновая кислота
АН - адениноые нуклеотиды
АОК - антителообразующие клетки
АТФ - аденозинтрифосфат
АФК (ROS) активные формы
кислорода
ADP - аденозиндифосфат AFC- 7-амино-4- трифторметилкумарин AIF - фактор, вызывающий апоптоз ANT - транспортер аденинового нуклеотида
APAF1 - апоптотический фактор 1, активирующий протеазы cGMP циклический
гуанозинмонофосфат CPR — цитохром Р450 редуктаза DIABLO - белок с низким значением изоэлектрической точки,
непосредственно связывающийся с IAP
DISC - индуцирующий смерть сигнальный комплекс FAD флавинадениндинуклеотид Fe-PPIX-железосо держащий протопорфирин IX FMN - флавинмононуклеотид GSH - глутатион восстановленный НЬ - гемоглобин
IAP - белок -ингибитор активности протеаз InsPj — инозитолтрифосфат L-ADMA - Кш-диметил-Ь-аргинин L-Arg - L-аргинин L-NIO - -иминоэтил-Ь-орнитин L-NMMA - №-монометил-Ь-аргинин L-NNA - Nm-HHTpo-L-apraHHH NADPH - никотинамиддинуклеотид фосфат
NOS - NO-синтаза NO - оксид азота (II) iNOS - индуцибельная NOS R24571 - калмидазолиум хлорид
SMAC - второй митохондриальный фактор, актививирующий каспазы TFP - трифторперазин VDAC - вольт -зависимый мембранный канал (voltage- dependent anion channel)
XIAP - Х-связанный IAP ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ГЗТ -гиперчувствительность
замедленного типа ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота КонА - конканавалин А LPS - бактериальный липополисахарид МДА -малоновый диальдегид МТТ - метил-тиазол-тетразолия бромид тест на активность митохондрий Н4В - тетрагидробиоптерин НИОТ - нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы НК - нуклеиновые кислоты НП - нуклеотидный препарат пдтк показатель дегрануляции тучных клеток ПОЛ -перекисиое окисление липидов ПТ- пароксизмальная тахикардия РНК -рибонуклеиновая кислота РТР - временно проницаемая пора (permeability transition pore)
СаМ - калмодулин
CAT - хлорамфеникол
ацетилтрансфераза сод - еупероксиддисмутаза СРР - свободнорадикальные реакции СУ (СССУ) - синдром слабости синусового узла ТА - Т-активин
ТБК - тиобарбитуровая кислота тРНК - транспортная РНК ТХУ - трихлоруксусная кислота ФГА - фитогемагглютинин цнс - центральная нервная система ЭБ - эритроциты барана ЭПР - электронно- парамагнитный резонанс
ЭР - эндоплазматический ретикулум

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Нуклеотиды и нуклеозиды: биологическая роль, участие в метаболических процессах, регуляции иммунитета, механизмов апоптоза и антиоксидантной защиты организма
ГЛАВА I. Материалы и методы исследований
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА II. Разработка метода получения и стандартизации комплексного нуклеотидного препарата из
дрожжей Saccharomyces cerevisiae
2.1. Выбор оптимальных условий культивирования дрожжей
Saccharomyces cerevisiae для получения нуклеотидного препарата
2.2. Исследование влияния состава среды в условиях периодического культивирования штаммов дрожжей Sacchromyces cerevisiae на выход нуклеотидных препаратов и эффективность их действия на
Са2+-зависимую NOS тимоцитов крыс Wistar
2.3. Исследование влияния состава среды при культивировании в условиях одноступенчатого хемостата дрожжей Sacchromyces cerevisiae
раса 14 на выход нуклеотидного препарата и эффективность
его действия на Са2т-зависимую NOS
2.4. Исследование влияния состава среды при культивировании в условиях турбидостата дрожжей Sacchromyces cerevisiae раса 14 на выход нуклеотидного препарата и эффективность его действия на Са +-зависимую NOS
2.5. Исследование влияния культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 при последовательном выращивании на средах с этанолом и
глюкозой на свойства нуклеотидных препаратов
ГЛАВА III. Изучение иммуномодулирующих свойств комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса
3.1. Исследование влияния нуклеотидного препарата на В-клсточное
звено иммунитета
3.2. Исследование влияния нуклеотидного препарата на Т-клеточное
звено иммунитета
ГЛАВА IV. Исследование антидиабетического действия комплексного нуклеотидного препарата на модели
диабета 2 типа
4.1 .Влияние нуклеотидного препарата на уровень содержания
глюкозы и инсулина в крови крыс с диабетом 2 типа

4.2. Влияние нуклеотидного препарата на показатели окислительного
стресса у крыс с диабетом 2 типа
ГЛАВА V. Исследование влияния нуклеотидного препарата
на культуры клеток перевиваемых опухолей и функциональное
состояние нейтрофилов крови человека
5.1. Влияние нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae
раса 14 на жизнеспособность клеток в культурах перевиваемых опухолей
5.2. Влияние нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae
раса 14 на процессы апоптоза в культурах перевиваемых опухолей
5.3. Влияние нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae
раса 14 на клеточный цикл перевиваемых опухолевых клеток
5.4. Влияние нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 на продукцию активных форм кислорода, фагоцитоз, клеточную
адгезию и дегрануляцию нейтрофилов
ГЛАВА VI. Доклиническое токсикологическое изучение
комплексного нуклеотидного препарата
6.1. Исследование токсичности комплексного нуклеотидного препарата при однократном введении лабораторным животным
6.2. Исследование токсичности комплексного нуклеотидного препарата в условиях 3-месячного хронического эксперимента на крысах Wistar
6.3. Исследование токсичности готовой лекарственной формы комплексного нуклеотидного препарата в условиях 2-месячного хронического
эксперимента на собаках
6.4. Изучение мутагенных свойств комплексного нуклеотидного препарата
6.5. Исследование эмбриотоксических и тератогенных свойств комплексного нуклеотидного препарата
6.6. Изучение влияния комплексного нуклеотидного препарата
на репродуктивную функцию
6.7. Изучение аллергизируюших свойств препарата
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

(оксигеназную и редуктазную) структуру NOS. Присутствие калмодулин-связывающей последовательности между Fe-PPIX и флавин- связывающими доменами энзима подтверждают роль СаМ в частичной переориентации этих доменов, что влияет на каталитическую активность NOS (Sheta Е.А. et al, 1994).
Ghosh D.K. et al (1995) показали, что эти домены влияют на голова-голова субъединичную ориентацию NOS (рис. 6).
Рис.6. Субъединичная ориентация бндомена NOS (по Ghosh D.K. et al 1995).
Анализ структуры Fe-PPIX в NOS показал, что он является симметричной бипирамидой, где одна вершина SH-группа ( Stuehr D.I. et al, 1992), a другая- свободная электронная пара, то есть железо в NOS является 5- координированным, что обуславливает не только ингибирование NOS продуктом (NO) (Rogers N.E. et al, 1992), но и формирование нескольких пространственных структур при связи Fe с шестым лигандом (Rousseau D.L. et al, 1996).
Особый интерес представляет Са2+ /СаМ-связывающий домен NOS, так как наличие или отсутствие зависимости изоформы NOS от Са2+ является одним из основных признаков разделения NOS на изоформы.
Классификация NO-синтаз, на 3 типа: нейрональную (nNOS),
макрофагальную индуцибельную (iNOS) и эндотелиальную (eNOS) основана на физических и биохимических характеристиках фермента, то есть на субклеточной локализации и регуляции Са2+. Данные по этой классификации, составленной по результатам исследований молекулярного клонирования и экспрессии (Bredt D.S et al. et al, 1991; Nakane H. et al, 1993; Xie O. et al, 1992), представлены в таблице 2 (Schmidt H. et al, 1993)