Физико-химические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы из серобактерий рода Beggiatoa

• Автор: Степанова, Ирина Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 145 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика малатдегидрогеназы
1.2.Очистка и физико-химические свойства малатдегидрогеназы
1.2.1. Очистка МДГ из бактерий
1.2.2. Физико-химические свойства МДГ
1.2.2.1. Молекулярная масса и субъединичное строение
1.2.2.2. Аминокислотный состав МДГ
1.3. Каталитические свойства малатдегидрогеназы
1.3.1. Общая характеристика каталитического действия
1.3.2. Кинетические параметры
1.3.3. Влияние концентрации ионов водорода на активность МДГ
1.3.4. Влияние температуры на активность МДГ
1.3.4.1. Термостабильность МДГ
1.3.4.2. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции
1.4. Регуляторные свойства
1.4.1. Аллостерическая регуляция
1.4.2. Регуляция посредством ассоциации-диссоциации олигомера
1.4.3. Влияние интермедиатов и ионов на активность МДГ
1.5. Изоферментный состав МДГ
1.6. Регуляция активности МДГ на генетическом уровне
1.7. Эколого-биохимическая характеристика рода Beggiatoa
1.7.1. Экологические особенности
1.7.2. Разнообразие типов метаболизма
1.7.2.1. Роль соединений серы в метаболизме бесцветных серобактерий
1.7.2.2. Роль кислорода в метаболизме серобактерий
1.7.3. Внутриклеточные включения
1.7.4. Особенности биохимической адаптации
1.7.5. Влияние кислорода как стрессового фактора на метаболизм__
1.7.6. Строение ЭТЦ у ВецщаЮа

1.7.7. Возможные пути защиты от высоких концентраций кислорода
у бактерий рода Beggiatoa
1.7.8. Механизмы, предупреждающие отравление сероводородом
1.8. Регуляция метаболизма у бактерий
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Цель и задачи исследования
2.2.Объекты и методы исследования
2.2.1. Объекты исследования
2.2.2. Методы исследования
2.2.2.1. Состав питательной среды для культивирования микроорганизмов
2.2.2.2. Создание микроаэробных условий в среде
культивирования
2.2.2.3. Определение активности ферментов
2.2.2.4. Определение количества белка
2.2.2.5. Выделение и очистка малатдегидрогеназы
2.2.2.5.1. Экстракция малатдегидрогеназы
2.2.2.5.2. Фракционирование белков с помощью сульфата
аммония
2.2.2.5.3. Гель-фильтрация
2.2.2.5.4. Ионообменная хроматография
2.2.2.6. Электрофоретические исследования
2.2.2.6.1. Аналитический электрофорез
2.2.2.6.2. Определение гомогенности ферментов
2.2.2.6.3. Специфическое проявление МДГ
2.2.2.6.4. Определение молекулярной массы субъединиц ферментов^
2.2.2.7. Определение молекулярной массы нативного фермента
2.2.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов
2.2.2.9. Аминокислотный анализ
2.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных
2.3. Полученные результаты и их обсуждение
2.3.1. Влияние различных условий культивирования на активность МДГ и некоторых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла

2.3.1.1. Культивирование бактерий Beggiatoa штамм Д-402 в среде с тиосульфатом и без тиосульфата
2.3.1.2. Влияние кислорода
2.3.2. Очистка малатдегидрогеназ из исследуемых бактерий
2.3.3. Физико-химические свойства малатдегидрогеназы
2.3.3.1. Определение молекулярной массы и субъединичного строения МДГ
2.3.3.2. Аминокислотный состав малатдегидрогеназ
2.3.4. Кинетические и регуляторные характеристики МДГ
2.3.4.1. Влияние концентрации ионов водорода
2.3.4.2. Определение константы Михаэлиса
2.3.4.3. Определение константы субстратного ингибирования
2.3.4.4. Влияние интермедиатов на активность МДГ
2.3.4.5. Влияние ионов на активность МДГ
2.3.4.6. Влияние температуры
2.3.4.6.1.Термостабильность МДГ
2.3.4.6.2. Температурный оптимум ферментативной реакции
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

конкурентно ингибировать МДГ (Марчиладзе, 1972, Землянухин и др., 1986).
Некоторые авторы (Vessal, Tabei, 1996) установили ингибирующий эффект на МДГ из печени овцы таких веществ как диэтилпирокарбонат (4 мМ), фруктозо-1-6-дифосфат (3 мМ), мебендазол (1мМ), цитрат (2 мМ). Фумарат, п-гидроксимеркурибензоат на фермент из этого объекта не влияли.
Малатдегидрогеназу из Tricliuris ovis ингибируют бензимидазол и пуримидиновые производные (Sanchez-Moreno et al., 1989), а из Clarias batrachus - эндосульфан и глюкозо-1-фосфат (Mishra, Shukla, 1997).
Другие соединения, такие как аскорбиновая кислота, сукцинат, масляная кислота не влияют на активность. В противоположность этому, взаимодействие МДГ с липидным слоем внутриклеточных мембран (Malick, Weiner, 1977), а также с у-аминомасляной кислотой повышает стабильность молекулярной структуры белка и увеличивает каталитическую эффективность фермента (Давранов и др., 1972).
Т.о., метаболитная регуляция способна играть важную роль в контроле функционального состояния и действия малатдегидрогеназы.
Большое влияние на активность МДГ оказывают ионы металлов. Более 16 металлов в виде микроэлементов играют важную роль в процессе роста и метаболизма микроорганизмов. Они необходимы для биосинтеза многих ключевых ферментов (Чернавина, 1970; Ильченко и др., 1994). Кроме того, ионы металлов, наряду с веществами органической природы, могут выступать в качестве интермедиатов, регулирующих работу ферментов. Активность одних ферментов заметно не изменяется в присутствии или отсутствии солей; активность других, напротив, очень сильно зависит от природы и концентрации находящихся в системе ионов. Известны катионы, которые ингибируют одни ферменты и активируют другие; некоторые ионы могут даже в зависимости от концентрации по-разному действовать на один и тот же фермент, подавляя или активируя его. Характер взаимодействия между ионом и ферментом может быть