Изучение механизмов АНТИ-ВИЧ активности производных высших тритерпенов и хинонов

• Автор: Ильина, Татьяна Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 117 с. : ил.

Список сокращений Введение
1. Обзор литературы
1Л. Вирус иммунодефицита человека
1.1.1. Краткое описание генома ВИЧ
1.1.2. Обратная транскриптаза ВИЧ
1.1.3 .Схема обратной транскрипции
1.2 Анти-ВИЧ терапия
1.2.1. Блокирование стадии адсорбции
1.2.2. Ингибиторы обратной транскрипции Аналоги субстратов Ненуклеозидные ингибиторы ОТ
Связывание ненуклеозидных ингибиторов с обратной транскриптазой ВИЧ
1.2.3. Ингибиторы других этапов жизненного цикла ВИЧ
1.3. Глицирризиновая кислота
Противовирусная активность глицирризиновой кислоты
2. Материалы и методы
2.1. Реактивы, используемые в работе
2.2. Буферные растворы.
2.3. Трансформация клеток Е.СоИ
2.4. Выделение обратной транскриптазы
2.5. ПААГ БББ-электрофорез
2.6. Определение скорости реакции, катализируемой ОТ
2.7. Определение кинетических параметров реакции
2.8. Исследование противовирусной активности соединений
2.9. Фаговый дисплей
3. Результаты и обсуждение
3.1 .Характеристика использовавшихся в работе вариантов обратных транскриптаз
3.2.Исследование ингибирующей активности ГК и ее производных в отношении ОТ ВИЧ
Активность производных ГК на культуре клеток Совместное ингибирование обратной транскриптазы ВИЧ-1 пента-О-никотинатом ГК и АЗТ
Совместное действие пента-О-никотината ГК и невирапина Совместное ингибирование ГК и азидотимидином Совместное действие АЗТ и пента-О-никотината ГК в культуре инфицированных клеток
3.3.Исследование ингибирующей активности бетулина и его производных
Активность производных бетулина в культуре клеток
3.4.Исследование ингибирующей активности антра- и нафтохинонов
Противовирусная активность производных хинонов
3.5.Поиск сайтов связывания глицирризиновой кислоты методом фагового дисплея
Характеристика отобранных фаговых клонов
Поиск гомологии отобранных пептидов с белками вирусов
человека
Г омология отобранных пептидов с белками ВИЧ Поиск гомологии отобранных пептидов с белками человека
4. Заключение Выводы
Список литературы От Автора

Список сокращений
АК аминокислота
АТ- антитело
АЗТ азидотимидин
БСА бычий сывороточный альбумин
ВИЧ-1 вирус иммунодефицита человека первого типа
ГК глицирризиновая кислота
дмсо диметил сульфоксид
дтт дитиотреитол
ИФА иммуноферментный анализ
ОТ обратная транскриптаза
ПААГ полиакриламидный гель
СПИД синдром приобретенного иммунодефицита
ЭДТА этилендиамин тетраацетат
cd50 цитотоксический индекс
І50 индекс ингибирования фермента
ED so индекс ингибирования размножения вируса
IS индекс селективности
kcat константа катализа
Км константа Михаэлиса
Кі константа ингибирования
IL интерлейкин
IPTG изопропил-бета-В-тиогалактопиранозид
LTR long terminal repeats, длинные концевые повторы
PBS праймер-связывающий сайт
SDS додецилсульфат натрия
TNF фактор некроза опухоли
» max максимальная скорость

Thr215—>Phe и мутантной ОТ с тремя заменами Asp67—»Asn; Lys70—>Arg; Thr215—»Phe (мутации, обусловливающие устойчивость к АЗТ, впервые описаны Larder et al, 1989). Характеристики полученных форм ОТ представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2. Характеристики выделенных форм ОТ.
ОТ ВИЧ-1 Замена в кодоне Аминокислотная замена
ДТ (дикий тип) - -
М(67) GAC—ААС Asp67—»Asn
М(215) АСС -> ТСС Thr215—>Phe
М(67,70,215) GAC -± ААС AAA -» ТАА АСС -> ТСС Asp67->Asn Lys70-»Arg Tlir215—>Phe
Таблица 3. Значения Км для ТТР, ксаЬ кса/Км, и величины кса1/'Км относительно ОТ дикого типа.
ОТ ВИЧ-1 Км (для TTP), mkM kcat ? С kcat /KM) mkM^xc'1 kcat /KM, OTH. ЄД.
ДТ 1,24±0,11 2,81 ±0,15 2,26
M(215) 1,47±0,08 2,40±0,22 1,63 0,7
M(67) 8,03±0,22 1,95±0,15 0,24 0Д
M(67,70,215) 12,01 ±0,26 1,52±0,12 0,12 0,05
Кинетические параметры реакции (Км и kcat) находили по уравнению Михаэлиса-Ментен используя программы Enzfitter («Elsevier Biosoft», Голландия) и Origin Professional 5.0 («Microcal Inc»). Значения К; и тип ингибирования находили графически с помощью координат Лайнуивера-Берка и Диксона (Уэбб Л., 1966) в серии из трех-пяти независимых экспериментов. Все измерения проводили на линейных участках зависимостей накопления продуктов от времени и концентрации фермента.