Разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции для мониторинга вируса гриппа А

• Автор: Киреев, Дмитрий Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Характеристика вирусов гриппа 1 П

1.1.1. Классификация И

1.1.2. Организация вириона и функции вирусных белков

1.1.3. Клинические признаки и патогенез

1.1.4. Эпизоотология и эпидемиология гриппа А

1.2. Диагностика гриппа А

1.2.1. Вирусологичекая диагностика

1.2.2. Серологическая диагностика

1.2.3. Обнаружение вирусного антигена
1.2.4. Молекулярная диагностика
1.3. Заключение по литературному обзору
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Штаммы и изоляты вирусов гриппа А
2.1.2. Химические реагенты
2.1.3. Реагенты и наборы для молекулярной биологии
2.1.4. Оборудование
2.1.5. Расходные материалы и лабораторная посуда
2.2. Методы
2.2.1. Выделение РНК вирусов гриппа из культуральных и полевых образцов
2.2.2. Постановка ОТПЦР для обнаружения РНК вируса гриппа А
2.2.3. Постановка ОТПЦР для обнаружения РНК вируса гриппа А и дифференциации его подтипов Н5 и Н7
2.2.4. Постановка ОТПЦР для обнаружения РНК вируса гриппа А
подтипа Н5 в реальном времени
2.2.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.6. Анализ результатов ОТПЦР в реальном времени
2.2.7. Конструирование рекомбинантных положительных контролей
III. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Разработка детекционной системы ОТПЦР для обнаружения вируса гриппа А на основе гнездовой ПЦР
3.2. Разработка детекционной системы ОТПЦР для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 на основе гнездовой ПЦР
3.3. Разработка детекционной системы ОТПЦР для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 с режимом получения результатов в реальном времени
3.4. Определение распространенности вируса гриппа А на территории Российской Федерации
IV. ОБСУЖДЕНИЕ
V. ВЫВОДЫ
VI. ПРИЛОЖЕНИЯ
VII. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В году в период вспыхнувшей эпизоотии в Гонконге впервые были зафиксированы случаи заражения человека вирусом гриппа подтипа Н5П, сопровождаемые высоким уровнем летальности из зараженных погибло 5 человек. Этот вирус, так называемый вирус птичьего гриппа, в году стал причиной новых случаев заболевания в странах Азии, гибели человек во Вьетнаме, Таиланде, Камбодже, Индонезии, и уничтожения 0 миллионов домашних птиц. В во время миграции диких птиц он распространился в северный Китай, Монголию, Тибет, Казахстан и Россию. Европы Румыния, Греция, Ближнего Востока, Кавказского региона 8. Необходимость мониторинга вируса гриппа А у птиц, человека и животных чрезвычайно велика. Вирусологические методы обнаружения вируса гриппа А пассирование на куриных эмбрионах или на культуре клеток с последующей идентификацией в реакции гемагглютинации РГА или реакции торможения гемагглютинации РТГА надежны и чувствительны, однако они довольно трудоемки и на их выполнение требуется от 1 до 2 недель 2. За последнее десятилетие широкое распространение получили молекулярные методы диагностики гриппа А. Наиболее известные и эффективные это методы полимеразной цепной реакции ПЦР и полимеразной цепной реакции в реальном времени. Принцип их работы основан на многократном умножении части генома инфекционного агента с последующей его идентификацией. Время анализа инфекционного материала такими методами снижается до одного дня, их чувствительность не уступает чувствительности традиционных методов . В рекомендациях Всемирной Организации Здравоохранения о диагностике гриппа А метод полимеразной цепной реакции приравнен к традиционным методам и рекомендован для использования 3. В настоящее время в мире существует ряд диагностических систем для обнаружения и типирования вирусов гриппа типа А на основе метода полимеразной цепной реакции. Недавно и в России начали появляться подобные наборы 7. Однако вариабельность генома вируса гриппа вызывает серьезные проблемы при диагностике и иногда является причиной появления ложно отрицательных результатов. В связи с этим увеличение количества разработанных диагностикумов для обнаружения РНК вируса гриппа А увеличивает вероятность правильной и надежной диагностики. Цель и задачи исследования. Целью работы являлась разработка на основе полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в реальном времени диагностических наборов для обнаружения и типирования вируса гриппа А и апробация их с образцами, полученными от различных видов птиц, животных и человека. Разработать дстекционную систему ОТПЦР для обнаружения вируса гриппа А на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена нукпеопротеина. Разработать детекционную систему ОТПЦР для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена гемагглютинина. Разработать систему ОТПЦР для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 с режимом получения результатов в реальном времени. Сравнить чувствительность разработанных дстскционных систем с традиционными методами обнаружения вируса гриппа и провести их тестирование с использованием имеющихся эталонных штаммов вируса гриппа А и полевых образцов от птиц. Научная новизна и практическая значимость. Разработана и внедрена детекционная система на основе ПЦР ТУ 4 от декабря г. А любого подтипа и дифференцировать их от вирусов гриппа В и С, а также от других патогенов. А подтипов Н5 и Н7 ТУ 2 от декабря г. Разработана и внедрена детекционная система на основе ПЦР в реальном времени, позволяющая обнаруживать вирусы гриппа А подтипа Н5 ТУ 3 от декабря г. Сравнительные результаты использования тестов для обнаружения вируса гриппа А методом ПЦР с вирусологическими методами свидетельствуют о возможности использования разработанных тестсистем для быстрого обнаружения вирусов гриппа А как в культуральном материале, так и в полевых образцах от птиц. Основные положения, выносимые на защиту. ПЦР. ПЦР. ПЦР в реальном времени повышение экспрессности метода по сравнению с гнездовой ПЦР при сохранении достаточной чувствительности для детекции вируса в образцах от клинически больных птиц. А в образцах от диких и домашних птиц.