Сравнительный анализ геномов половой и бесполой распланарии Girardia tigrina методом вычитающей гибридизации

• Автор: Ребриков, Денис Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Методы сравнения двух образцов ДНК
1.1. Дифференциальный скрининг.
1.2. Методы дифференциального дисплея.
1.3. Методы вычитающей гибридизации.
1.4. Некоторые из результатов сравнения эукариотических геномов.
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Морфологические и функциональные особенности пресноводных планарий.
2.2. Получение библиотек фрагментов ДНК, обогащенных последовательностями, дифференциально представленными в геномах половой и бесполой рас планарий.
2.3. Анализ обогащенной библиотеки фрагментов суммарной ДНК.
2.4. Структура полученных фрагментов ДНК.
2.5. Специфичный для бесполой расы планарий вирусоподобный элемент (РЕУЕ).
2.6. Заключение.
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Материалы и оборудование.
3.2. Методы исследования.
3.3. Приложение.
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Строение каждого живого существа определяется последовательностью нуклеотидов геномной ДНК. Различия в строении живых организмов есть следствие различий в строении их геномов.
Определение различий в организации геномов близкородственных организмов является первым шагом на пути к пониманию процессов видообразования и механизмов уникальных биохимических процессов, лежащих в основе клеточного метаболизма, свойственных данному организму или группе организмов. Несмотря на большое разнообразие методов, до сих пор нет достаточно совершенного инструмента, позволяющего найти уникальные последовательности ДНК, различающиеся в двух эукариотических геномах. Разработка эффективных методов поиска таких различий позволит сравнивать структуры генома, детерминирующие тот или иной биологический процесс на молекулярном уровне.
В настоящий момент вычитающая гибридизация занимает все более важное место в ряду методов, используемых для выделения транскриптов, отличающих один тип клеток от другого, или последовательностей, отличающих один геном от другого. Вычитающая гибридизация позволяет быстро получать структурную информацию о различиях между клетками и использовать полученную информацию для дальнейшего функционального анализа. Разработанный нами метод зеркально ориентированной селекции, базирующийся на методе вычитающей гибридизации, значительно повышает вероятность нахождения дифференциально представленных последовательностей в образцах ДНК с высокой сложностью, таких, как кДНК клеток мозга или геномная ДНК эукариот.
Целью данной работы являлось создание нового эффективного метода вычитающей гибридизации сложных образцов ДНК, а также применение разработанного метода для сравнительного анализа эукариотических геномов на примере пресноводной планарии Girardia tigrina.
Разработанный метод, получивший название «метод зеркально ориентированной селекции, mirror orientation selection, MOS», был успешно применен в ряде экспериментов, включая сравнение образцов кДНК коры
головного мозга мышей на разных стадиях развития и сравнение суммарных препаратов ДНК пресноводной планарии (г. й?#ппа.

исследований в бесполых планариях были обнаружены 6 гомеобоксных генов [ТагаЬукт е1 а!., 1995]. В дальнейшем, 5 из этих генов были обнаружены в геноме половой (испанской) расы планарий и выявили 100% сходство по последовательности нуклеотидов с генами бесполой расы. Этот факт также может служить подтверждением генетической близости половой и бесполой рас планарий.
Учитывая все вышесказанное, мы пришли к выводу, что две выбранных расы планарий представляют обоснованную модельную систему для изучения различий между половым и бесполым типом репродукции и могут быть использованы для вычитания геномов.
2.2. Получение библиотек фрагментов ДНК, обогащенных последовательностями, дифференциально представленными в геномах половой и бесполой рас планарий.
2.2.1. Стратегия вычитающей гибридизации.
Метод БЗН основан на эффекте супрессии ПЦР, определяемом длинными концевыми повторами, присоединенными по концам фрагмента ДНК [81еЬе1Г е1 ей., 1995]. За счет введения эффекта супрессии в схему ПЦР амплификации, метод БЗН нормализует представленность последовательностей внутри амплифицируемой популяции фрагментов ДНК и предотвращает амплификацию нежелательных фрагментов ДНК. Схема Б8Н включает следующие основные шаги: 1. Разделение трейсерной ДНК на два образца и лигирование к этим образцам двух разных супрессионных адаптеров; 2. Гибридизацию каждого из образцов трейсера с избытком драйвера; 3. Объединение гибридизованных образцов трейсера друг с другом и с новой порцией денатурированного драйвера; и 4. Амплификация молекул ДНК трейсера, фланкированных разными супрессионными адаптерами (данная фракция содержит обогащенные и нормализованные целевые молекулы) (Рис. 1-1) [Э1а1сЬепко е1 ей., 1996, вш^кауа ег а!, 1996, Э1а1с1зепко е( а1, 1999, СЬепсЫк е( ей., 1998].