Ингибирование неорганической пирофосфатазы из дрожжей монеэфирами фосфорной кислоты различного строения

• Автор: Свято, Ирина Евгеньевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 157 c. : ил

Глава I. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ И

СТРОЕНИЯ ИХ АКТИВНОГО ЦЕНТРА С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА

АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ (Обзор литературы)

1. Оксиредуктазы

2. Трансферазы

3. Гидролазы

4. Лиазы

5. Изомеразы

6. Лигазы
Глава II. ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ПЙРО-ФОСФАТАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ С МОНОЭФИРАМИ ФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ РАЗЛИЧНОГО СТРОЕНИЯ (Обсуждение результатов)
1. Центры связывания аффинных ингибиторов неорганической пирофосфатазы
2. Кооперативные взаимодействия субъединиц в неорганической пирофосфатазе
3. Роль четвертичной структуры пирофосфатазы в аффинной модификации
4. Расположение аффинных ингибиторов в активном центре неорганической пирофосфатазы
Глава III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
1. Исходные вещества
2. Методы исследования
2.1. Хроматография

2.2. Обнаружение веществ на хроматограммах
2.3. Определение радиоактивности
2.4. Количественное определение неорганического
фосфата
2.5. Количественное определение содержания фосфора в модифицированном белке
2.6. Определение концентрации белка
а) Определение концентрации нативного фермента
б) Определение концентрации иммобилизованного
фермента
2.7. Определение ферментативной активности пирофосфатазы
3. Исследование реакции неорганической пирофосфатазы
с моноэфирами фосфорной кислоты
3.1. Инактивация пирофосфатазы под действием метил-фосфата, фосфогликолевой кислоты, Ы-ацетилфос-фосерина, 0-фосфоэтаноламина, 0-фосфопропаноламина и метилового эфира О-фосфосерина
3.2. Реакция пирофосфатазы с моноэфирами фосфорной кислоты в присутствии субстрата - неорганического пирофосфата
3.3. Расчет констант скорости и констант ингибирования
3.4. Модификация неорганической пирофосфатазы моноэфирами фосфорной кислоты
3.5. Зависимость скорости инактивации фермента
от концентрации моноэфиров фосфорной кислоты
3.6. Влияние ингибиторов на кинетику гидролиза пирофосфата магния

3.7. Получение фермент-субстратного комплекса, стабилизированного фторидом

3.8. Влияние моноэфиров фосфорной кислоты на
реактивацию фермент-субстратного соединения пирофосфатом натрия

3.9. Влияние моноэфиров фосфорной кислоты на
реактивацию фермент-субстратного соединения триполифосфатом натрия

ЗЛО. Получение пирофосфатазы, модифицированной
на 50# метилфосфатом, Ы-ацетилфосфосерином, О-фосфопропаноламином или О-фосфоэтаноламином
3.II. Изучение кинетики реактивации фермента,
модифицированного метилфосфатом, Ы-ацетилфос-фосерином или О-фосфопропаноламином, под действием пирофосфата натрия, триполифосфата натрия и хлористого магния
4. Кооперативные взаимодействия субъединиц в неорганической пирофосфат азе
4.1. Получение пирофосфатазы с одной модифицированной субъединицей
4.2. Протеолиз субтилизином нативной и модифицированной пирофосфатазы
4.3. Протеолиз субтилизином неорганической пирофосфатазы, модифицированной М-ацетилфосфосерином, в присутствии имидодифосфата натрия и Mcj^+
5. Исследование значения четвертичной структуры пирофосфатазы для протекания аффинного ингибирования
5.1. Иммобилизация пирофосфатазы

гентом за счет блокирования существенного остатка лизина в ДНК--связывающем центре /133/.
При обработке пиридоксаль-5 фосфатом ./-тромбина (КФ 3.4. 21.5) человека, катализирующего гидролиз фибриногена до фибрина, также наблюдается полная потеря активности вследствие модификации двух лизиновых остатков белка /134/. Скорость взаимодействия реагента с двумя центрами различна. Реакция с более быстро модифицируемым остатком лизина приводит к утрате фибриногенсвертывающей активности, а модификация второй группы сникает чувствительность тромбина к активирующему действию гепарина в реакции с антитромбином.
Фосфолипаза С (КФ 3.1.4.3) катализирует гидролиз фосфатидил-холина до 1,2-диглицерида и холинфосфата. Для фермента из Вас tlus! cereas пиридоксаль-5 '-фосфат является аффинным ингибитором /135,136/. Полное подавление ферментативной активности наблюдается при включении двух молей реагента на активный центр. При этом образуется основание Шиффа между аминогруппой существенных остатков лизина и альдегидной группой ингибитора. Один модифицированный лизиновый остаток принадлежит Н-концевому фрагменту (Ь-^5 б), а второй - располагается близко к единственному остатку пролина в фосфолипазе С /136/. Считают, что оба остатка лизина являются существенными для ферментативной активности, но, вероятно, не для связывания субстрата /135/.
В фосфолипазе А2 (КФ 3.1.1.4) из яда гадюки ЪСШ даёонсеа. при использовании пиридоксаль-5/-фосфата также выявлен важный для функционирования фермента остаток лизина /137/.
Фруктозо-1,б-дифосфатаза, (КФ 3.1.3.4) катализирует гидролиз 'D -фруктозо-1,6-дифосфата до D -фруктозо-6-фосфата и неорганического фосфата. При изучении фермента из печени кролика применялся пиридоксаль-5 фосфат в качестве специфической метки как ак-