Разработка эффективной технологии получения фармацевтических препаратов генно-инженерного инсулина и его аналогов

• Автор: Гусаров, Дмитрий Алексеевич
• Шифр специальности: 02.00.10, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 177 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Инсулин.

2. Способы производства инсулина человека

2.1. Полусинтстичсский и генноинженерный способы

2.2. Ферментативное превращение предшественника в инсулин

2.3. Методы очистки инсулина.

2.4. Валидация процессов и аналитического контроля в производстве биофармацевтических препаратов.

3. Фармацевтические аналоги генноинженерного инсулина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Постановка задачи.
2. Ферментативный гидролиз предшественника инсулина
2.1. Внутрипроизводственный контроль ферментативного гидролиза.
2.2. Ферментативный гидролиз влияние температуры
2.3. Ферментативный гидролиз оптимальные концентрации реагентов
2.4. Производственный ферментативный гидролиз
2.5. Ферментативный гидролиз обратимая модификация лизина В.
3. Разработка и валидация метода контроля производства ГИЧ.
3.1. Линейность
3.2. Правильность и точность сходимость и воспроизводимость
3.3. Предел обнаружения и нижний предел количественной оценки
3.4. Специфичность.
3.5. Устойчивость метода.
3.6. Выводы
4. Хроматографическая очистка инсулина.
4.1. Подготовка опытного образца.
4.2. Изучение состава подвижной фазы.
4.3. Определение оптимальной нагрузки на сорбент
4.4. Определение оптимальной геометрии колонны
4.5. Подбор оптимальной неподвижной фазы
4.6. Очистка от эндотоксинов клеточной стенки, нроинсулинподобных полипептидов и высокомолекулярных примесей.
4.7. Производственная очистка инсулина
4.8. Валидация процесса хроматографической очистки инсулина.
5. Технология получения и очистки инсулинааспарта и инсулинализпро.
МАТЕРИАЛЫ, ПРИБОРЫ И МЕТОДЫ.
1. Материалы
1.1. Реактивы.
1.2. Хроматографические сорбенты и колонны
2. Приборы
2.1. Хроматографические системы.
2.2. Оборудование.
3. Методы
3.1. Контроль производства ГИЧ методом ОФ ВЭЖХ
3.2. Контроль содержания дТИ методом ионпарной ОФ ВЭЖХ.
3.3. Контроль содержания ВМП методом
3.4. Получение рекомбинантных предшественников
3.5. Проведение ферментативного гидролиза.
3.6. Проведение ВЭЖХочистки
3.7. Проведение гельфильтрации.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ
БЛАГОДАРНОСТИ
БИБЛИОГРАФИЯ


Т.Биден обнаружил также, что пищевые раздражители после метаболического превращения опосредованно передают на рклетки сигнал, резко повышающий
чувствительность к Са секреторного аппарата и, повидимому, связанный с активацией протеинкиназ. Интересна методология биосинтеза инсулина в клетке . Инсулин является продуктом протеолиза другой белковой молекулы нроинсулина Рис. Рис. Схематическое изображение нроинсулина человека серым цветом показана аминокислотная последовательность, соответствующая Снсп гиду белым инсулину. Проинсулин синтезируется в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме Рклеток островков Лангерганса поджелудочной железы в виде предшественника прспроинсулина молекулярная масса примерно 0 Да . Лидерная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков, направляет молекулу предшественник в аппарат Гольджи и там отщепляется . В результате образуется молекула проинсулина молекулярная масса примерно Да, принимающая конформацию, необходимую для правильного образования дисульфидных мостиков. Затем проинсулин расщепляется трипсиноподобным ферментом на инсулин, Спептид и два дипептида и депонируется в секреторных гранулах . Далее содержимое этих гранул секретирустся в воротную вену . До попадания в периферическую кровеносную систему, инсулин и Спептид направляются в печень, где деградирует инсулина, в то время как Спептид не подвергается никаким воздействиям. Впервые структура молекулы инсулина установлена Сенджером в г
Рис. Схема расположения лпсульфидных связей в молекуле инсулина. Молекула инсулина полипептид, состоящий из двух цепей Рис. А и В. Молекулярная масса инсулина равна ,6 Да. Аминокислотная последовательность инсулина человека приведена ниже Рис. Цепи инсулина ковалентно связаны между собой двумя дисульфидными связями А7В7 и АВ. Также в молекуле инсулина имеется еще одна дисульфидная связь в Ацепи А6А . А и Вцепи у представителей большинства видов животных имеют по и аминокислотных остатков соответственно. Рис. Первичная структура молекулы инсулина человека. Среди животных инсулинов различною происхождения в обеих цепях во многих положениях встречаются аминокислотные замены, не оказывающие влияния на биологическую активность гормона, однако наиболее распространенными являются замены по 8, 9 и положению Ацепи Таблица 1. Из этого следует, что данный участок, скорее всего, не имеет критического значения для биологической активности инсулина. Таблица I. Замены в аминокислотной последовательности различных инсулинов. С другой стороны, некоторые участки и области молекулы обладают высокой консервативностью. С и Ыконцевые участки Ацепи. Использование химических модификаций и замен отдельных аминокислотных остатков в этих участках помогли идентифицировать структуру активного центра инсулина. Расположенный на Сконце Вцепи гидрофобный участок участвует также в димеризации инсулина. Цинк, концентрация которого в рклетках островков Лангерганса достигает высоких значений, формирует комплексы с инсулином и проинсулином. Инсулины всех позвоночных образуют димеры с помощью водородных связей между пептидными группами остатков В и В двух мономеров, которые при высоких концентрациях, в свою очередь, реорганизуются в гексамеры, содержащие по два атома цинка в каждом. Наличие такой высокоупорядоченной структуры существенно облегчило изучение кристаллической структуры инсулина. Это объясняется наличием прогормона проинсулина, пол и пептидная цепь которого включает последовательность из аминокислот, отсутствующая в инсулине. Это связывающий пептид Спептид от английского i связывающий который расположен между карбоксильным концом Вцепи и концом цепи будущего инсулина. Проинсулин обладает способностью к формированию правильно расположенных дисульфидных связей после обработки восстанавливающими агентами и последующей ренатурации. После замыкания дисульфидных мостиков, стабилизирующих молекулу проинсулина в целом, трипсиноподобная цротеиназа вырезает Спептид . Точки воздействия этой протеиназы предопределены двумя факторами пространственной структурой проинсулина и присутствием в его полипептидной цепи двух пар катионных аминокислот, расположенных в последовательности следующим образом Вцепь Спептид цепь Рис.