Эндонуклеазы рестрикции Ssoll, PspGI и Mbol: изучение свойств и определение ДНК-связывающих мотивов

• Автор: Судьина, Анна Евгеньевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 186 с. : ил.

Условные сокращения
Глава 1. Эндонуклеазы рестрикции как компоненты системы рестрикции-модификации ДНК: классификация, структура и функции (Обзор литературы)
1.1. Общая характеристика систем рестрикции-модификации
1.2. Функции систем рестрикции-модификации
1.3. Номенклатура систем рестрикции-модификации
1.4. Классификация систем рестрикции-модификации
1.5. Организация систем рестрикции-модификации 1-го, П-го и Ш-го типов
1.5.1. Системы рестрикции-модификации 1-го типа
1.5.2. Системы рестрикции-модификации П1-го типа
1.5.3. Системы рестрикции-модификации П-го типа
1.5.3.1. Классификация систем Р-М П-го типа
1.6. Эндонуклеазы рестрикции П-го типа
1.6.1. Структурная организация эндонуклеаз рестрикции ЭР П-го типа
1.6.2. Механизмы взаимодействия ЭР П-го типа с ДНК
1.6.2.1. Стадия связывания ДНК ферментом
1.6.2.2. Конформационные изменения ДНК и ЭР при образовании фермент-субстратного комплекса
1.6.2.3. Специфическое узнавание ДНК ЭР и формирование каталитически активного фермент-субстратного комплекса
1.6.3. Каталитические механизмы расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции
1.6.3.1. Переход от узнавания к катализу
1.6.3.2. Механизм гидролиза фосфодиэфирной связи
1.6.3.3. Структура активного центра ЭР П-го типа
1.6.3.4. Механизм катализа с участием одного иона металла
1.6.3.5. Механизм катализа с участием двух ионов металла
1.6.3.6. Механизм катализа с участием трех ионов металла
1.6.4. Применение эндонуклеаз рестрикции П-го типа в молекулярнобиологической практике

Глава 2. Эндонуклеазы рестрикции БвоП, РБрС1 и МЬо1: изучение свойств и определение ДНК-связывающих доменов (Обсуждение результатов)
2.1. Сравнительный анализ первичной структуры ЭР БбоП, РБр01 и МЬо1
2.2. Разработка нового метода тестирования активности ЭР П-го типа
2.3. Изучение биохимических свойств ЭР ЗбоП, РБрСТ и МЬо1
2.3.1. Определение параметров взаимодействия ЭР 8боП, РБрИ
и МЬо1 с ДНК
2.3.2. Влияние pH среды и концентрации ЫаС1 на активность ЭР ЗбоП,
РБрИ и МЬо1
2.3.3. Влияние концентрации ионов Mg2+ на активность ЭР йбоП,
РБрС1иМЬо1
2.4. Определение функционально важных аминокислотных остатков ЭР ЗбоП,
РБр01 и МЬо1, участвующих в узнавании и связывании ДНК-субстрата, методом сайт-направленного мутагенеза
2.5. Зондирование контактов в комплексах ЭР ЗбоП, РэрИ и МЬо1 с ДНК-субстратами методом аффинной модификации
2.5.1. Использование ДНК-субстатов, содержащие фосфорилдисульфидную группу, для анализа взаимодействий в комплексе ЭР БбоП и РБр01 с ДНК
2.5.2. Модификация ЭР РБрСТ под действием азидофенацилбромида
2.5.3. Анализ ДНК-белковых взаимодействий в комплексах ЭР БбоП и
МЬо1 с ДНК с помощью 2' -альдегидсодержащих субстратов
2.6. Построение филогенетического дерева для ЭР П-го типа и моделирование структуры активных центров ЭР ЗбоП и РэрИ
2.6.1. Эволюционная взаимосвязь между различными ЭР И-го типа
2.6.2. Сравнение вторичной структуры ЭР ЗбоИ, РБрСТ и МЬо1 и моделирование структуры активных центров ЭР ЗбоИ и РБр01
Глава 3. Экспериментальная часть
3.1. Реактивы и материалы
3.2. Приборы и методы
3.3. Общие методики
3.3.1. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей
ЭР П-го типа
3.3.2. Синтез иммобилизованных олигонуклеотидов
3.3.3. Введение 32Р- и флуоресцентной меток в олигонуклеотиды
3.3.4. Проведение ферментативных реакций

3.3.5. Синтез протяженных ДНК-дуплексов
3.3.6. Выделение препаратов природной и мутантных форм ЭР SsoII,
PspGI и Mbol
3.3.7. Определение четвертичной структуры ЭР SsoII, PspGI и Mbol и стехиометрии их комплексов с ДНК методом гель-фильтрации
3.3.8. Исследование равновесного связывания ЭР SsoII, PspGI и Mbol с
ДНК-дуплексами
3.3.9. Определение константы скорости гидролиза ДНК-субстратов
ЭР SsoII, PspGI и Mbol
3.3.10. Исследование зависимости активности ЭР SsoII, PspGI и Mbol
от pH среды
3.3.11. Исследование зависимости активности ЭР SsoII, PspGI и Mbol
от концентрации NaCl и MgCh
3.3.12. Реакция ЭР SsoII и PspGI с ДНК-дуплексами, содержащими фосфорилдисульфидную группу
3.3.13. Фотохимическая модификация ДНК азидофенацильными производными ЭР PspGI
3.3.14. Ковалентное присоединение ЭР SsoII и Mbol к ДНК-дуплексам, содержащим 2' -альдегидную группу
3.3.15. Молекулярное моделирование активных центров ЭР SsoII и PspGI 158 Выводы
Список литературы

«скольжение» фермента вдоль ДНК (рис. 18, а), так и «перескакивание» фермента на несколько пар нуклеотидов (рис. 18, б) [223,224].
«скольжение» вдольДНК «перескакивание» вдольДНК
(sliding) {hopping and jumping)
Рис. 18. Две составляющие процесса линейной диффузии фермента вдоль ДНК. а -«Скольжение» по двойной спирали ДНК. б - «Перескакивание» вдоль молекулы ДНК.
«Скольжение» представляет собой вращательное движение фермента по бороздке ДНК, а «перескакивание» подразумевает чередование процессов ассоциации и диссоциации эндонуклеазы с ДНК. Также одной из разновидностей линейной диффузии может быть переход ДНК с одного ДНК-связывающего участка фермента на другой в пределах одной белковой глобулы («intersegment transfer»).
Процесс линейной диффузии фермента вдоль ДНК играет ключевую роль не только при поиске эндонуклеазой специфического участка узнавания [225, 226]. Он также способствует диссоциации комплекса ЭР с продуктом реакции [227] и функционированию эндонуклеаз по процессивному механизму [228, 229]. Следует отметить, что в процессе линейной диффузии эндонуклеазы не пропускают ни одного участка узнавания, при этом на последовательностях, сходных с узнаваемыми, ЭР приостанавливаются в своем движении, однако потом следуют дальше [230]. Присутствие других белков, прочно связанных с ДНК, или наличие необычных структур самой двойной спирали приводят к остановке продвижения ЭР вдоль ДНК. Также, на расстояние непрерывного «скольжения» оказывает значительное влияние ионная сила раствора, особенно концентрация ионов Mg2+ [228,231].
1.6.2.2. Конфирмационные изменения ДНК и ЭР при образовании фермент-субстратного комплекса
ЭР при своем продвижении вдоль ДНК непрерывно сканируют большую, а, возможно, и малую бороздки ДНК-спирали в поиске специфического набора структурных элементов, характерных для участка узнавания конкретного фермента. Обнаружение специфической последовательности инициирует кооперативный переход неспецифического комплекса в специфический. Это влечет за собой не только значительные конформационные изменения в