α-Гарпинины - защитные пептиды растений

• Автор: Опарин, Петр Борисович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 113 с. : ил.

Оглавление
Введение

Цель и задачи работы

Обзор литературы

Введение. Иммунитет растений

Антимикробные пептиды растений

Дефензины
Тионины

Гевеиноподобные пептиды

Липид-переносящие белки

Ноттиноподобные пептиды

Макроциклические пептиды (циклотиды)
Ингибиторы а-амилэз
Ноттиноподобные ИАА
ИАА дефензинового типа
Ингибиторы протеаз
Ингибиторы сериновых протеаз
ИП семейства Кунитца
ИП семейства Баумана-Бирка (ББИ)
ИП семейства тыквенные (Squash)
ИП семейства горчичные (MSI - от англ. Mustard (Sinapis) trypsin inhibitor)
ИП картофеля типа 1 (PI 1)
ИП картофеля типа II (PI 2)
Фитоцистатины, растительные ингибиторы цистеиновых протеаз
Злаковые ингибиторы трипсина/а-амилаз
1 ULS
Ингибиторы аспартатных и металлопротеаз

Заключение
Материалы и методы
1. Материалы
2. Оборудование
3. Расходные материалы
4. Штаммы бактерий и грибов
5. Растворы
6. Программное обеспечение
7. Методы
1. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ)
2. Масс-спектрометрия
3. Восстановление дисульфидных связей дитиотреитолом
4. Алкилирование тиольных групп 4-винилпиридином
5. Определение N-концевой аминокислотной последовательности
6. Селективный гидролиз полипептидов
7. Определение концентрации полипептидов. УФ-спектрофотометрия
8. Полимеразная цепная реакция
9. Рестрикция линейных фрагментов ДНК и плазмиды рЕТ-32Ь
10. Лигирование линейных фрагментов ДНК и лианеризованной плазмиды рЕТ-32Ь
11. Электрофорез в агарозном геле
12. Выделение ДНК из агарозного геля
13. Трансформация E. coli методом электропорации
14. Трансформация E. coli методом теплового шока
15. Выделение плазмидной ДНК

16. Секвенирование ДНК
17. Контролируемая экспрессия гибридного белка в клетках E. coli
18. Выделение растворимой фракции белков из клеток E. coli
19. Аффинная хроматография
20. Ферментативный гидролиз гибридного белка с использованием энтеропептидазы
21. Гель-электрофорез в полиакриламидном геле
22. Тестирование ингибирующей активности
23. Приготовление липосом
24. Тестирование способности пептидов к взаимодействию с липидными везикулами
25. Измерение антифунгальной активности
26. Спектроскопия кругового дихроизма
27. Твердофазный пептидный синтез
28. Замыкание дисульфидных связей
Результаты и обсуждение
1. Выделение и структурная характеристика ингибитора трипсина из семян гречихи
2. Получение искусственных аналогов пептидов
3. Структурные исследования полученных пептидов
4. Особенности биосинтеза а-гарпининов
5. Исследование биологической активности полученных пептидов
6. Получение производных а-гарпининов, исследование их структуры и активности
Выводы
Благодарности
Список использованной литературы

Установление пространственной структуры SFTI-1 методом кристаллографии показало, что молекула ингибитора представляет собой двух-тяжевой антипараллельный ß-слой. Небольшой размер и жесткая структура сводят к минимуму коиформационные изменения и связанные с ними энтропийные потери при взаимодействии с активным сайтом фермента, что делает данный ингибитор значительно эффективнее большинства известных аналогов [271]. Кроме того, сходной с ББИ пространственной организацией обладают некоторые ингибиторы цистеиновых протеаз [272] (рисунок б).
ИП семейства тыквенные (Squash)
Ингибиторы данного семейства были описаны только у растений и обнаружены в семенах ряда представителей семейства тыквенные (Cucurbitaceae) [274-277], чем и обусловлено название группы. Они представляют собой небольшие (-30 а.о.) одноцепочечные пептиды массой 3-3,5 кДа, содержащие по три дисульфидные связи [274] и формирующие в пространстве структуру ноттинового типа [159,278,279]. Отдельные представители этой группы ИП имеют циклическую структуру н обладают антимикробной активностью, на основании чего они также выделяются в качестве подсемейства макроциклических АМП [277,280] (рисунок 7).
ИП семейства горчичные (MSI - от англ. Mustard (Sinapis) trypsin inhibitor)
MSI ингибиторы представляют собой группу небольших (~7 кДа) пептидов, обнаруженных по большей части в семенах растений семейства крестоцветные (Cruciferae) [281-283]. Содержат четыре дисульфидные связи. Пространственная структура была установлена для предшественника ингибитора трипсина из Arabidopsis thaliana ATTp методом ЯМР [284] (рисунок 7). Этот пептид состоит из а-спирали и двух антипараллельных ß-тяжей, соединенных посредствам ß-поворота. а-Спираль и ингибиторная петля связаны с ß-слоем тремя дисульфидными связями, а четвертая связь соединяет N- и С-концы молекулы. MSI ингибируют преимущественно сериновые протеазы по стандартному механизму [285], но для RT1-2 из рапса (Brassica napus) было показано ингибирование глутамилэндопептидазы из Streptomyces griseus [286].