Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов

• Автор: Годовикова, Татьяна Сергеевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 419 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
РАЗДЕЛЕ ФОТО АФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ 15 СТРУКТУР МАТРИЧНОГО БИОСИНТЕЗА: ПРОБЛЕМЫ И
ПЕРСПЕКТИВЫ (обзор литературы)
ЕЕ Подходы к синтезу фотоактивируемых аналогов компонентов
надмолекулярных структур матричного биосинтеза для решения задач по выявлению точек контакта между биополимерами
1.1.1. Ферментативные методы введения фотоактивируемых групп в ДНК и 22 РНК
1.1.2. Химико-ферментативные методы получения фотоактивируемых
фрагментов ДНК и РНК
1.1.3. Химические методы введения фотоактивируемых групп в ДНК и РНК
1.1.4. Роль би- и полифункциональных реагентов в получении специфичных
фотоактивируемых белков
1.1.5. Заключение к разделу 1.1
1.2. Структурно-функциональные исследования нуклеопротеидных
комплексов рибосом про- и эукариот методом фотоаффинного сшивания
1.2.1. Рибосомные белки и нуклеотиды рРНК прокариот, сшивающиеся с
фотоактивируемыми аналогами мРНК
1.2.2. Расположение мРНК в области декодирования по данным
фотоаффинной модификации рибосом человека фотоактивируемыми аналогами мРНК
1.2.3. Пептиды фактора терминации трансляции eRFl, сшивающиеся с
фотоактивируемыми аналогами мРНК в составе терминирующих комплексов
1.2.4. Метод «импульсной фотоаффинной сшивки» для исследования
динамики взаимодействия тРНК с разными участками рибосомы
1.2.5. Заключение к разделу 1.2
1.3. Фотоаффинная модификация белково-нуклеиновых комплексов
матричного биосинтеза нуклеиновых кислот
1.3.1. Некоторые примеры использования метода фотоаффинной
модификации биополимеров для структурно-функциональных исследований РНК-полимераз
1.3.2 Примеры исследования структурно-функциональной организации
комплексов репликации и репарации ДНК эукариот методом фотоаффинной модификации биополимеров
1.3.3. Заключение к разделу 1.3
1.4. Проблемы селективности и эффективности фотоаффинного мечения
компонентов надмолекулярных комплексов и пути их решения
1.4.1. Фотоаффинная модификация белков, основанная на синтезе
радиоактивного фотоактивируемого реагента in situ
1.4.2. Каталитически компетентное мечеиие как подход для селективной
модификации белково-нуклеиновых комплексов
1.4.3. Применение бинарной системы фотоаффинных реагентов для
высокоселективной модификации белков в надмолекулярных комплексах
1.4.4. Влияние строения арилазида на эффективность и селективность

фотоаффинной модификации биополимеров реагентами на основе ароматических азидов
1.5 Заключение к разделу 1
РАЗДЕЛ 2. МЕХАНИЗМЫ ФОТОИНДУЦИРОВАННОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
РЕАГЕНТОВ НА ОСНОВЕ АРОМАТИЧЕСКИХ АЗИДОВ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ ГРУППАМИ БЕЛКОВ (результаты и их обсуждение)
2.1. Специфичность и эффективность модификации функциональных
групп биополимеров арилазидными реагентами
2.2. Фотоиндуцированные реакции арилазидных реагентов в условиях
проведения фотоаффинной модификации белков
2.2.1. «Темновые» стадии при фотоаффинной модификации белков 151 реагентами на основе л-азидоанилина и (4-азидофенил)-Аг-алкиламина
2.2.2. Механизмы фотоиндуцированных реакций я-азидофенилфосфата в
условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров
2.2.2.1. Проблемы, возникающие при интерпретации результатов 157 экспериментов по фотоаффинной модификации белков реагентами на основе л-азидофенилфосфата
2.22.2. Фотохимические превращения л-азидофенилфосфата при его 158 облучении в водных растворах
2.2.2.3. 3’,5’-Диметилиндофенол как продукт фотоиндуцированного 164 взаимодействия л-азидофенилфосфата с 2,6-диметилфенолом
2.2.2.4. л-Азидофенилфосфат как фотоактивируемый фосфорилирующий
реагент
2.2.3. Механизм фотолиза я-нитрозамещенных арилазидов в условиях
проведения фотоаффинной модификации биополимеров
2.2.3.1. Фотоиндуцированные превращения У-(5-азидо-2-нитробензоил)-1,3
диаминопропана при его облучении в водных растворах
2.2.3.2. Фотоиндуцированные превращения 4-нитрофенилазида при его
облучении в водных растворах
2.2.4. Фотолиз перфторированного ароматического азида в водном растворе
2.3. Разработка общего методического похода к изучению строения
продуктов фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов
2.3.1. Фотоиндуцированная аффинная модификация стрептавидина
фотоактивируемыми аналогами биотина
2.3.1.1. Синтез 5-азидо-2-нитро-У-{2-[5-(2-оксогексагидротиено[3,4-с1]
имидазол-6-ил)пентаноиламино]-этил}-бензамида, 5-азидо-2-нитро-У-{3-[5-(2-оксогексагидротиено[3,4-d] имидазол-6-ил)пентаноиламино] -пропил} -бензамида и 5-азидо-2-нитро-Л'-{4-[5-(2-оксогексагидро-тиено[3,4-с!]имидазол-6-ил)пентаноил-амино]-бутил}-бензамида
2.3.1.2. Связывание фотоактивируемых аналогов биотина с лиганд
связывающим центром субъединиц стрептавидина
2.3.1.3. Фотоиндуцированные превращения фотоактивируемых аналогов
биотина при их облучении в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров
2.3.1.4. Структурный и спектральный анализ продуктов фотоиндуцированного
взаимодействия фотоактивируемых аналогов биотина с функциональными группами стрептавидина
2.3.2. Продукты фотоиндуцироанного взаимодействия
5-азидо-2-нитробензоильных реагентов с аминокислотными остатками в условиях сближения реагирующих групп

2.3.2.1.
23.2.2.
2.3.2.3.

2.3.3.1.
2.3.3.2.
2.3.3.3. РАЗДЕЛ 3.

3.1.1.1.
3.1.1.2.

3.2.2.1.
3.2.2.2.
3.2.2.3.
3.2.2.4.
Синтез Лг-{2-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропионила.мино]-этил}-5- 209 азидо-2-нитробензамида и Л-{3-[2-амино-3-(Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-5-азидо-2-нитробензамида Фотоиндуцированное взаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильной 210 группы с боковым радикалом тирозина
Фотоиндуцированное взаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильной 221 группы с боковым радикалом триптофана
Продукты фотовзаимодействия 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной 228 группы с аминокислотными остатками в условиях сближения реакционных центров
Синтез производных ароматических аминокислот, несущих остаток 228 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты
Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с 229 боковым радикалом тирозина
Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с 235 боковым радикалом триптофана
ПОДХОДЫ К СИНТЕЗУ ФОТОАФФИННЫХ РЕАГЕНТОВ НА 244 ОСНОВЕ АРОМАТИЧЕСКИХ АЗИДОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БЕЛКОВО-НУКЛЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ (результаты и их обсуждение)
Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие арилазидные группы на 246 концевом моиоэтерифицированном фосфате, как реагенты для фотоаффинной модификации белков
Синтез арилазидных реагентов - производных 246 олигодезоксирибонуклеотидов - по их терминальной моноэтерифицированной фосфатной группе
Некоторые аспекты амидирования 5’-концевых
моноэтерифицированных фосфатов олигонуклеотидов при использовании трифенилфосфина и 2,2’-дипиридилдисульфида Фосфорилирующие производные нуклеотидов и олигонуклеотидов с 255 цвиттер-ионной группой как промежуточные соединения при получении арилазидных аффинных реагентов и других амидофосфатов Фотоиндуцированное взаимодействие арилазидных производных 274 олигонуклеотидов с белками хроматина
Арилазидные производные нуклеозид-5’-трифосфатов и 279 2’-дезоксирибонуклеозид-5’-трифосфатов: синтез и использование в матричном биосинтезе аффинных реагентов - фотоактивируемых производных олиго- и полинуклеотидов
Фотоактивируемые аналоги инициирующего субстрата 280 РНК-полимеразы II на основе арилазидных производных у-амидофосфатов ТГТР
Арилазидные С-5-аналоги сІІГГР и ЦТР: синтез и субстратные свойства 293 в тестах с ДНК- и РНК-полимеразами
Синтез аналогов 1ІТР и сШТР, содержащих остатки ароматических 294 азидов, соединенных с С-5 положением урацила линкерами разного строения
Синтез 5-{Аг-[Ап-(5-азидо-2-нитробензоил)-3-аминопропионил]амино 298 метил}-2’-дезоксиуридин-5’-[а- Рфтрифосфата
Введение фотоактивируемых групп в нуклеиновые кислоты в процессе 301 матричного биосинтеза в системах с ДНК-полимеразами Введение фотоактивируемых групп в РНК в процессе матричного 308 биосинтеза в системе с РНК-полимеразой

С привлечением генно-инженерных технологий были получены мутантные белки, содержащие вместо природной аминокислоты остаток цистеина в интересующих положениях Р3-р4 петли субдомена «пальцы» субъединицы рбб (положения 65, 67, 70 и 74). Дальнейшая обработка полученных мутантных белков специфическими в отношении бокового радикала СуБ полифункциональными реагентами, содержащими расщепляемые группировки, приводила к образованию фотоактивируемых белков (рис. 12). Для того чтобы проследить за изменением расстояния между ДНК-субстратом и определенными положениями на поверхности фермента при связывании его с ингибитором, авторами использовались гетерополифункциональные реагенты с разной длиной линкера: и-азидофенилтиофталимид (АРТР) - 8 А, 8-(2-пиридил)-8’-{М-[3-(3-трифторметил диазирин-3-ил)бензоил]аминоэтил}дисульфид (РТНВЕОЗ) - 11 А и А-бромацетил-АГ-{2,3-дигидрокси-3-[3-(3-трифторметилдиазирин-3-ил)фенил]пропионил}этилендиамин (ВАТОНР) - 16 А (см. рис. 12).
Было обнаружено, что ни введение остатка цистеина, ни присоединение по нему фотоактивируемой группы не вызывает существенного изменения ферментативной активности ОТ ВИЧ-1. С использованием сконструированных фотоактивируемых мутантных белков в работе [123] было показано, что эффективность сшивания их с одноцепочечным участком матрицы значительно ниже в составе тройного комплекса, чем в составе двойных комплексов. Авторами работы [39] было обнаружено, что в экспериментах с диазириновыми реагентами (особенно в случае реагента, содержащего более длинный линкер) эффективность мечения повышается при связывании комплексов с ингибитором ненуклеозидной природы, причем в случае фотоактивируемых ферментов, модифицированных по положениям 70 и 74, сшивание происходит вблизи активного центра полимеразы. Этот эффект наиболее выражен в отсутствии бЫТР. Предварительное инкубирование ОТ ВИЧ-1 с ингибитором ослабляет влияние связывания сШТР. Полученные результаты можно объяснить снижением конформационной подвижности субдомена «пальцы» в составе комплекса фермент»ингибитор. Кроме этого, по мнению авторов [39], возможно, что в присутствии ингибитора уменьшается расстояние от субдомена до одноцепочечного участка матрицы.