Синтез олигонуклеотидов с гидрофобными заместителями и их применение для детекции повреждений в ДНК

• Автор: Андреев, Сергей Юрьевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с. : ил.

1. Литературный обзор
ДНК-сенсоры па основе углеродных и золотых электродов. Детекция гибридизации и структурных дефектов ДНК электрохимическими методами
1.1. Введение
1.2. Принципы основных электрохимических методов, упоминаемых далее в тексте
1.4. Иммобилизация ДНК на углеродных электродах
1.4.1. Иммобилизация ДНК прямой адсорбцией
1.4.2. Нековачентная иммобилизация ДНК методом приложения потенциала
1.4.3. Ковалентная иммобилизация ДНК па поверхности электрода
1.5. Детекция ДНК на углеродных электродах
1.5.1. Детекция с использованием электрохимических индикаторов
1.5.1.1. [Со(ркеп)3]3+
1.5.1.2. [Со(Ыру)з]3+
1.5.1.3. Дауномицин
1.5.1.4. [ОвОз.Ыру]
1.5.1.5. Метиленовый синий
1.5.2. Прямая детекция по пикам окисления гетероциклических оснований
1.6. Иммобилизация ДНК на золотых электродах
1.6.1. Самоорганизующиеся монослои на золотых поверхностях
1.6.2. Ковалентное связывание ДНК с предварительно сформированными самоорганизующимися монослоями бифункциональных соединений
1.6.3. Формирование монослоев тиолсодержащей ДНК
1.6.4. Образование монослоев ДНК, содержащих тиофосфатные диэфирные связи.
1.7. Детекция ДНК на золотых электродах
1.7.1. Детекция с использованием электрохимических индикаторов
1.7.1.1. Детекция с использованием метиленового синего
1.8. Заключение
2. Обсуждение результатов
Синтез олигонуклеотидов с гидрофобными заместителями и их применение для детекции повреждений в ДНК
2.1. Цель работы
2.2. Химическая модификация олигонуклеотидов. Методы введения гидрофобных остатков в олигонуклеотиды для ковалентной и нековачентной иммобилизации
2.2.1. Синтез олигонуклеотидов, содержащих остатки олеиламина
2.2.2. Получение и свойства олигонуклеотидов, содержащих линкер с сулъфгидрильной группой на 5 ’-конце
2.3. Свойства олигонуклеотидов, содержащих остатки олеиламина
2.3.1. Исследование термической стабильности дуплексов, образованных модифицированными олигонуклеотидами

2.3.2. Устойчивость олигонуклеотидов с остатками олеиламина к 78 ферментативному гидролизу
2.3.3. Ферментативное лигирование олигонуклеотидов, содержащих остатки 80 олеиламина
2.3.3.1. Ферментативное лигирование олигонуклеотидов в водных растворах в 83 отсутствие липосом
2.3.3.2. Ферментативное лигирование олигонуклеотидов в присутствии липосом
2.3.4. Влияние олигонуклеотидов с гидрофобными заместителями на свойства 89 фосфолипидных монослоев на границе раздела вода-воздух
2.4. Создание прототипа ДНК-биосенсора для детекции точечных повреждений в
ДНК-дуплексах
2.4.1. Иммобилизация олигонуклеотидов на поверхности золотого электрода
2.4.2. Выбор электрохимического индикатора и метода анализа
2.4.4. Определение наличия и количества АП-сайтов в двухцепочечной ДНК 104 методом дифференциачъной импульсной вольтамперометрии
2.4.5. Определение наличия дезаминированных оснований в двухцепочечной ДНК
3. Экспериментальная часть
3.1. Материалы и методы
3.2. Синтез олигонуклеотидов
3.3. Синтез модифицированных звеньев для введение в олигонуклеотиды
3.4. Определение кинетических параметров ферментативного гидролиза 119 олигонуклеотидов (III) и (IX) ФДЭ змеиного яда
3.5. Липосомы диолешфосфатидилхолина
3.6. Ферментативное лигирование олигонуклеотидов
3.7. Изотермы зависимости поверхностного давления от площади поверхности
3.8. Создание монослоев тиолсодержащих олигонуклеотидов на золоте
3.9. Электрохимическая детекция метиленового синего и ферроцианида калия на 122 ДНК-модифицированных электродах
ВЫВОДЫ '
4. Список литературы

1. Литературный обзор
ДНК-сенсоры на основе углеродных и золотых электродов. Детекция гибридизации и структурных дефектов ДНК электрохимическими методами.
1.1. Введение
В настоящее время область электрохимических исследований ДНК находится в стадии интенсивного развития, вызванного интересом к созданию электрохимических датчиков для определения нуклеотидной последовательности и детекции точечных повреждений в ДНК-дуплексах [1-3]. Совершенствующиеся методы диагностики, предупреждения и лечения многих типов заболеваний требуют создания новых эффективных и недорогих устройств для определения последовательности ДНК и РНК. Быстрые, точные и, в то же время, доступные методы детекции дефектов в структуре ДНК, кроме того, необходимы при проведении экологических исследований. Основным преимуществом электрохимических устройств детекции является их доступность -быстрый отклик, небольшие размеры, простота использования и низкие затраты энергии в процессе работы.
Классические амперометрия и полярография - основные электрохимические методы анализа, существовавшие в начале 80х годов XX века, со временем перестали удовлетворять требованиям, выдвигаемым к методам анализа ДНК. Олиго- и полинуклеотиды заданной последовательности, синтезируемые химическими методами, а также методами генетической инженерии в плазмидах и вирусах, были дороги и требовали чувствительных методов анализа. С этой точки зрения биохимические и молекулярнобиологические методы анализа имели преимущество, поскольку позволяли иметь дело с меньшими количествами веществ.
Необходимостью уменьшения предела обнаружения ДНК на порядки вызвано появление уникальных методов электрохимического анализа, связанных с изучением поведения фрагментов ДНК на электродных поверхностях. В частности, группой под руководством Палечека было обнаружено, что ДНК способна легко адсорбироваться на поверхности ртутных и углеродных электродов при их погружении в раствор олигонуклеотидов на несколько минут [4-7]. Эти исследования положили начало работы с ДНК-модифицированными электродами, которые в течение следующего десятилетия стали доминировать в качестве основы биосенсоров, используемых для качественного и количественного определения ДНК [3, 8].

вольтамперометрией с использованием в качестве индикатора ферроцианид-иона. Однако, эффективность гибридизации иммобилизованной ДНК с комплементарными фрагментами из раствора оказалась очень небольшой (лишь менее 10% комплементарных олигонуклеотидов образовали дуплексы).
Аналогичные 18-звенные олигонуклеотиды, содержащие повторы из пяти тиофосфатных звеньев на 5’-конце, использовались для иммобилизации группой Вильнера [115-117]. 18-звенные олигонуклеотиды, содержащие тиофосфатные группы на З’-концс или одновременно на обоих концах, использовались Хиаником и соавт. [118] для модификации золотых электродов с целью последующей детекции ДНК-гибридизации. Во избежание неспецифической адсорбции на участках поверхности золота, не покрытых ДНК, электрод после иммобилизации олигонуклеотидов обрабатывали раствором 11-меркаптоундекановой кислоты

=> Очевидно, что непосредственная иммобилизация тиолсодержащих ДНК
обладает рядом преимуществ перед связыванием модифицированных фрагментов ДНК с предварительно сформированными монослоями. Универсальность методики и широкая распространенность тиольных линкеров для модификации ДНК позволяет свести все операции по созданию сенсора к ряду несложных процедур, которые могут быть воспроизведены практически в любой лаборатории. К недостаткам метода можно отнести нестабильность в водных растворов свободных тиолов и возможность окислительной димеризации олигонуклеотидов, в связи с чем требуются дополнительные стадии блокирования и удаления тритильной или дисульфидной защитной группы и незамедлительная иммобилизация на золоте деблокированных олигонуклеотидов. Избежать стадий деблокирования позволяет использование тиофосфатных диэфирных связей для связывание с поверхностью золота. В этом случае, однако, требуется введение сразу нескольких модифицированных звеньев на конец олигонуклеотида.