Получение и применение изотопомеров белков для количественного масс-спектрометрического определения белков в биологических объектах

• Автор: Манойлов, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 116 с. : ил.

Перечень используемых сокращений

Глава 1. Обзор литературы по теме исследования

1.1. Принципы работы масс-спектрометров и их источников ионизации

для анализа белков

1.1.1. Масс-спектрометрия с ионизацией типа электроспрей

1.1.2. Масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбционной ионизацией (МЛДИ, МАПЛ)

1.1.3. Качественное и количественное определение белков с помощью

технологии БЕЦ)!

1.2. Масс-спектрометрическое определение концентрации белков

1.2.1. Стадии пробоподготовки при проведении массспектрометрического определения концентрации белков

1.2.2. Теория изотопного разбавления

1.2.3. Способы введения метки
1.2.3.1. Метаболический способ введения метки
1.2.3.2. Химические способы введения метки
1.2.3.3. Использование меченых синтетических аминокислот и
пептидов
1.2.3.4. Протеолитические способы введения метки
1.2.4. Масс-спектрометрическое определение концентрации белков без использования изотопов
1.2.5. Применение технологий получения изотопомеров для решения реальных задач в последние годы
1.2.6. Преимущества и недостатки существующих на данный момент способов получения изотопомеров белков
1.3. Дезамидирование остатков аспарагина и глутамина
1.4. Свойства белков, использованных в работе

1.4.1. Свойства альбумина
1.4.2. Альфа-1-антитрипсин
1.4.2.1. Биохимические свойства
1.4.2.2. Методы анализа а ]-антитрипсина
1.4.3. Альфа-2-макроглобулин
1.4.4. Стрептокиназа как активатор плазминогена
1.5. Цель и задачи работы
Материалы и методы
Глава 2. Получение изотопно-модифицированных пептидов и белков
для масс-спектрометрического определения их концентрации
2.1.Предпосылки для разработки нового способа получения изотопомеров
2.2. Новый способ получения изотопомеров
2.3. Оптимизация условий проведения изотопного обмена
2.4. Дезамидирование в условиях изотопного обмена
2.5. Точность определения концентрации белков
2.6. Выводы по главе
Глава 3. Практическое использование изотопомеров
3.1. Схемы масс-спектрометрического определения концентрации
белков
3.1.1. Схема масс-спектрометрического определения концентрации альбумина в сыворотке крови
3.1.2. Схема масс-спектрометрического определения концентрации а,-антитрипсина и а2-макроглобулина
3.2. Определение активности стрептокиназы
3.3. Выводы по главе
Заключение
Основные результаты и выводы
Список публикаций по теме диссертации
Список цитируемой литературы

Таблица 1.3. (продолжение) Сравнительный анализ известных способов масс-спектрометрического
определения концентрации белков и пептидов в биологических объектах
Способ введения метки Исполь- зуемые техноло- гии Принцип Преимущества Недостатки
Ферментативный [35, 36] При протеолизе белка или пептида добавляют воду Н2180. Не обязательно осуществлять введение метки полностью, так как изотопное распределение образца измеряется непосредственно перед анализом. При использовании этой методики происходит разрушение образца. В разные пептиды метка вводится с разной скоростью. Необходимо создание индивидуального стандарта. Невозможно провести определение концентраций белков в смеси.
Все описанные выше способы введения метки успешно применяют для определения концентрации белков в биопробах, однако, не свободны от вышеперечисленных недостатков. Так, например, невозможно получить изотопомеры белков или их смесей без нарушения химической структуры белка. К тому же, синтетические пептиды с мечеными аминокислотами (метод AQUA) - очень дорогостоящие. Поэтому в настоящий момент ведется поиск более универсальных и доступных способов введения изотопной метки в белки и пептиды, который можно применять для масс-спектрометрического определения концентрации белков и пептидов в биологических объектах.