Исследование механизмов реакций S-центрированных радикалов и нуклеофилов с нитронными спиновыми ловушками методами ЯМР и ЭПР

• Автор: Потапенко, Дмитрий Иванович
• Шифр специальности: 01.04.17
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 150 с. : ил.

Глава 1. Литературный обзор. S-центрированные радикалы и 7 нуклеофилы in vivo и in vitro.
§1.1. Короткоживущие реакционные радикалы и интермедиаты в 7 биологии.
Краткая историческая справка
О-, С- и S- центрированные радикалы in vivo
§1.2. SH-соединения и сульфиты
Тиолы и SH-содержащие белки
* Сульфиты
Ox-Red статус
Методы регистрации тиолов
§1.3. Метод спиновых ловушек
Суть метода
Применение метода спиновых ловушек для регистрации 30 короткоживуших радикалов in vivo.
Фармакологические свойства спиновых ловушек
Артефакты в методе спиновых ловушек
Окисление примесей в спиновых ловушках
Обратный спиновый захват
Ф Механизм Форрестера-Хэпбурна
Реакция циклоприсоединения
Реакции с участием ионов переходных металлов
Механизмы гибели радикальных аддуктов
§1.4. Метод ЯМР спиновых ловушек
Глава 2. Исследование механизма реакции S-центрированных 54 нуклеофилов с нитронными спиновыми ловушками.
§2.1. Результаты
Исследование механизма реакции ДЭФМПО с сульфитом
Исследование механизма реакции ДМПО с сульфитом
Ф Исследование механизма реакции спиновых ловушек с тиолами
§2.2. Обсуждение полученных результатов
Обсуждение результатов исследования механизма реакции 64 ДЭФМПО с сульфитом.
Продукты и механизм реакции
Описание кинетических зависимостей образования Р/ и Р2 в 68 реакции сульфита с ДЭФМПО Обсуждение результатов исследования механизма реакции 71 ДМПО с сульфитом.
Продукты и механизм реакции
Анализ температурной зависимости
Определение вклада механизма Форрестера -Хэпбурна в

формирование радикального аддукта ДМПО и сульфитного радикала.
Обсуждение результатов исследования механизма реакции 75 спиновых ловушек с тиолами.
§2.3. Обобщение результатов по первой главе
Глава 3. Исследование механизма гибели радикальных аддуктов S- 80 центрированных радикалов с нитронными спиновыми ловушками.
§3.1 Результаты
Детектирование продуктов реакции спиновых ловушек с 81 тиильными радикалами методами ЭПР и ЯМР 31Р.
Исследование механизма гибели радикальных аддуктов 83 нитронных спиновых ловушек с глутатионовым радикалом методом ЭПР.
Доказательство обратимости реакции спинового захвата 84 глутатионового радикала нитронными спиновыми ловушками.
Образование ДЭФМПО/GS' радикального аддукта в ходе 84 гибели ДМПО/GS".
Образование радикала СО{~ из ДМПО/GS" в присутствии 86 формиата.
§3.2 Анализ кинетических данных
Кинетическая схема гибели радикального аддукта ST/GS*
Анализ кинетической зависимости накопления радикального 90 аддукта DMPO/CCh'* в присутствии формата.
Накопление нитрона ДЭФМПО-SG при фотолизе GSNO
Определение констант скоростей реакции GS* радикала 93 ДЭФМПО и GSNO методом лазерного импульсного фотолиза.
§3.3 Обсуждение полученных результатов
Глава 4. Исследование механизма реакции дисульфида 2,3,5,6- 98 тетрафтор-парамеркапто-бензойной кислоты с низко- и высокомолекулярными тиолами.
§4.1 Результаты:
§4.2 Обсуждение полученных результатов
Механизм реакции
Обсуждение причин уширения линий ДЛ’АЙ и В$Н
§4.3. Применение ВввВ для определения содержания тиолов в крови 109 §4.4 Достоинства, недостатки и перспективы развития метода
Глава 5. Экспериментальная часть
Используемая аббревиатура
§5.1. Реагенты
§5.2 Методы
§5.2.1. Измерения методом ЭПР
§5.2.2. Измерения методом ЯМР
Ex vivo ЯМР измерения аддуктов ДЭФМПО
Изучение механизма реакции сульфита с ДЭФМПО
Изучение механизма реакции сульфита сДМПО
Изучение механизма реакции ДЭФМПО с тиогликолевой 116 кислотой
Изучение механизма реакции BSSB с тиолами
Ex vivo ЯМР измерения содержания тиолов в крови
§5.2.3. Измерения методом УФ-спектроскопии
§5.2.4. Фотолиз светом УФ лампы
§5.2.5. Фотолиз светом лазера
§5.2.6. Измерения методом лазерного импульсного фотолиза
§5.3. Расчеты и обработка результатов измерений
Выводы
Приложение 1. Параметры спектров ЭПР некоторых радикальных 121 аддуктов
Приложение 2. Параметры спектров ЯМР
Благодарности
Список литературы

образовании ДМПО/ОН*. В качестве доказательства данного факта приводится эксперимент по исследованию гибели ДМПО/ООН* в присутствии этанола. Спиновый захват а-гидроксиэтильного радикала ДМПО указывает на образование ’ОН радикала в ходе гибели ДМПО/ОН’ 37. В качестве объяснения предложена следующая реакция (1.53):
')0 —- ■» * азд
НЭС | ООН н3С N Н
О* о
Следует отметить, что других доказательств существования данной реакции, кроме генерации ОН* радикала, в литературе не приводится.
§1.4. Метод ЯМР спиновых ловушек.
Не всякое продолжение есть развитие.
Г. Бальтасар.
Метод ЭПР спиновых ловушек, несмотря на свою высокую чувствительность, имеет все же значительные ограничения к применению in vivo. В основном из-за быстрого восстановления радикальных аддуктов как внутри клеток, так и вне них, в диамагнитные продукты, нерегистрируемые методом ЭПР. Чтобы обойти это ограничение недавно был предложен метод спиновых ловушек, детектируемых по ЯМР диамагнитных продуктов (ЯМР спиновых ловушек) 33'34. Суть метода заключается в детектировании методом ЯМР диамагнитных продуктов дальнейшей конверсии радикальных аддуктов. При этом значительно меньшая чувствительность метода ЯМР компенсируется возможностью накопления значительных количеств детектируемых продуктов.
Использование ПМР не всегда оказывается возможным, особенно in vivo, из-за относительно небольшого диапазона химических сдвигов и сложных биологических систем, спектры ЯМР *Н которых перекрываются со спектрами интересующих продуктов деградации радикальных аддуктов. Поэтому наиболее перспективным считается использование магнитного резонанса на ядрах 31Р, 19F, 13С, ,5N и т.д., которые в биологических молекулах либо не присутствуют, либо присутствуют в ограниченном количестве. Поэтому необходимым оказывается