Экспрессия рафт-образующих белков при немелкоклеточном раке легкого и ее влияние на свойства неопластических клеток

• Автор: Шнейдерман, Анастасия Николаевна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 149 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИПИДНЫЕ РАФТЫ И РАФТ-ОБРАЗУЮЩИЕ БЕЛКИ. ОБЗО Р ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Липидные рафты - микродомены в составе клеточных мембран

1.2. Общие представления о строении и функционировании липидных

РАФТОВ

1.3. Рафт-образующие белки: разнообразие и отдельные представители

1.4. Структура и локализация рафт-образующих белков

1.4.1. Строение кавеолинов и кавеол

1.4.2. Строение и локализация флотиллинов

1.4.3. Семейство стоматинов: строение и локализация
1.5. Функции рафт-образующих белков
1.5.1. Везикулярный транспорт
1.5.2. Миграция и образование клеточных контактов
1.5.3. Деградация внеклеточного матрикса
1.5.4. Гомеостаз холестерола
1.5.5. Транспорт глюкозы
1.5.6. Роль флотиллинов в активации Т-лимфоцитов
1.5.7. Участие стоматина в регуляции активности натриевых каналов
1.6. Роль рафт-образующих белков в опухолевой трансформации и прогрессии
1.6.1. Двоякая роль кавеолина-1 в канцерогенезе
1.6.2. Роль флотиллинов в канцерогенезе
1.6.3. Роль стоматин-подобных белков в канцерогенезе
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Характеристика исследованных опухолевых образцов

2.2. Клеточные линии
2.3. Выделение нуклеиновых кислот
2.3.1. Выделение нлазмидной ДНК
2.3.2. Выделение РНК из клеточных культур и образцов опухолевых тканей
2.3.3. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей
2.4. Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях
2.5. Молекулярное клонирование
2.5.1. Получение компетентных клеток Е
2.5.2. Трансформация компетентных клеток E.coli
2.5.3. Обработка ДНКрестрицирующими эндонуклеазами
2.5.4. Реакция лигирования
2.5.5. Клонирование кодирующей последовательности генов с кДНК
2.5.6. Клонирование предшественников малых шпилечных РНК
2.6. Образ ная транскрипция РНК
2.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.7.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени
2.7.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) на плазмидных ДНК
2.8. Трансфекция
2.9. Инфекция псевдовирусными частицами
2.10. Анализ белков
2.10.1. Приготовление белковых лизатов
2.10.2. Вестерн-блот гибридизация
2.10.3. Приготовление образцов для определения ферментативной активности протеиназ
2.10.4. Анализ желатинозной активности
2.10.5. Анализ активности иРА
2.11. Исследование клеточных характеристик in vitro
2.11.1. Анализ динамики роста клеток

2.11.2. Анализ клеточной подвижности в тесте на зарастание «раны» in vitro (wound healing assay)
2.11.3. Анализ клеточной подвижности в камерах Бойдена
2.11.4. Выделение ядер клеток и проведение исследования клеточного цикла на проточном цитофлуориметре
2.12. Статистическая обработка результатов
2.13. Список растворов, сред и реактивов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Анализ продукции рафт-образующих белков в образцах НМРЛ
3.1.1. Определение продукции белков флотиллин-1, флотиллин-2 и стоматин методом Вестерн-блот анализа
3.1.2. Корреляционный анализ изменения продукции флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина
3.1.3. Определение уровня относительной экспрессии гена FL0T-2 в группе АК с помощью ПЦР в реальном времени
3.1.4. Обсуждение результатов исследования клинических образцов
3.2. Анализ продукции рафт-образующих белков в клеточных линиях НМРЛ
3.3. Получение ретровирусных векторов и клеточных линий А549 и Н358 с гиперэкспрессией генов FLOT-1, FLOT-2 и STOM
3.4. Получение лентивирусных векторов с мшРНК к генам FLOT-1 и FLOT-2 И КЛЕТОЧНЫХ линий А549 и H460 с подавленной экспрессией данных генов
3.5. Исследование характеристик полученных клеточных линий в КУЛЬТУРЕ IN VITRO
3.5.1. Изучение экспрессии рафт-образующих белков в клеточных линиях с гиперэкспрессией генов FLOT-1, FLOT-2 и STOM
3.5.2. Изучение экспрессии рафт-образующих белков в клеточных линиях
с подавленной экспрессией генов FLOT-1 и FLOT

[42;46]. Другим возможным механизмом является способность флотиллинов взаимодействовать с адапторным белком ArgBP2 (Arg-binding protein 2) [77]. Этот белок имеет на N-конце консервативный SoHo (sorbin homology] домен, за счет которого он связывается с флотиллинами, и три БЫЗ-домена на С-конце, взаимодействующие с различными сигнальными молекулами, в частности, с киназой Рук2 и адапторным белком СЫ. На модели нейронов человека PC 12 показано, что при действии ростовых факторов комплексы Pyk2-ArgBP2-Cbl привлекаются в липидные рафты, содержащие флотиллин-1, где Рук2 и СЫ активируют последующие участники сигнальных каскадов. В результате происходит реорганизация цитоскелета, приводящая к усилению образования ламеллоподий в растущих нервных клетках [75].
Характерной чертой многих опухолевых клеток является пониженная адгезивность к другим клеткам и внеклеточному матриксу (ВКМ), что усиливает миграционную активность трансформированных клеток. Известно, что и кавеолины, и флотиллины локализуются в плазматической мембране в области межклеточных и фокальных контактов [78]. |При разрушении межклеточных контактов в культуре мышиных эмбриональных фибробластов экспрессия флотиллина-1 и кавеолина-1 сильно снижается, но восстанавливается при образовании связей между клетками [76]. Известно, что пониженная адгезивность к другим клеткам может быть связана с нарушением образования межклеточных контактов за счет потери экспрессии Е-кадгерина. Введение вектора с этим геном в клетки карциномы яичников не восстанавливает межклеточных контактов, однако дополнительная трансфекция вектора с геном СА V-1 приводит к нормальному распределению Е-кадгерина в мембране и установлению его связи с [3-катенином [79]. Таким образом, за счет влияния на распределение молекул Е-кадгерина кавеолин-1 участвует в образовании межклеточных контактов.
Недавние исследования, проведенные Solis с соавторами на клетках эпидермальной карциномы человека, показали, что флотиллины также могут