Сравнительная оценка методов выявления антиэритроцитарных антител

• Автор: Моисеенкова, Людмила Геннадиевна
• Шифр специальности: 14.00.29
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : 3 ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. Обзор литературы. Особенности антиэритроцитарных антител и методов их выявления

1.1. Структура антител

1.2. Классы

1.3. Характеристика классов

1.4. Функциональная активность субклассов

1.5. Клиническое значение антител

1.6. Методы исследования антиэритроцитарных антител

1.7. Факторы, влияющие на реакцию антиген-антитело
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1. Материал исследования
2.2. Методы исследования
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. Сравнительная характеристика антиэритроцитарных антител и методов их выявления
3.1. Оценка серологических параметров сывороток
3.2. Частота антиэритроцитарных антител 1§С1 и 03 у
аллосенсибилизированных лиц русской национальности
3.3. Частота субклассов антиэритроцитарных антител, не выявляемых в
каком-либо из методов
Глава 4. Гемолизирующая активность антител
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Аллоиммунизация является одной из причин возникновения посттрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных. Выявление аллоиммунных антиэритроцитарных антител имеет большое значение для пациентов, нуждающихся в многократных трансфузиях эритроцитсодержащих компонентов (Walker et al., 1989 [191]; Regan et al., 1997 [159]). Кроме того, наличие аллоиммунных антител к эритроцитарным антигенам у реципиента существенно снижает лечебный эффект проводимой гемо-трансфузионной терапии (Ю. М. Зарецкая 1983 [26]; Е. В. Бутина и соавт., 1998 [8]). Таким образом, аллоиммунизация антигенами эритроцитов представляет собой глобальный популяционный процесс (С. И. Донсков и соавт., 2001 [19]).
До настоящего времени сравнительная оценка (валидация) методов исследования антиэритроцитарных антител, применяемых в Российской Федерации, в полном объеме не проводилась. Рядом авторов осуществлялись работы по сравнению отдельных методов, предназначенных в основном для определения резус-фактора. Так, А. Г. Башлай в 1960 году [5, 6] провела сравнение усовершенствованного ею желатинового метода Фиска-Мак Ги [88] с методом агглютинации в солевой среде Винера [197]. Метод А. Г. Башлай, получивший название: «реакции конглютинации в пробирках с 10% желатином при температуре 46-48°С», до сих пор с успехом используется в учреждениях службы крови Российской Федерации.
А. Я. Ашкенази в 1962 году [3, 4] сравнивала два метода: разработанный ею экспресс-метод определения резус-фактора на предметных стеклах с использованием гепаринизированных сывороток и широко применяемый в то время метод определения резус-фактора в сывороточной среде на чашках Петри, предложенный Н. И. Блиновым и Н. С. Дробышевой [7]. Результаты исследования обоими методами практически совпали за исключением редких случаев трудноопределимого антигена Du.
О. В. Успенская в 1966 году [60] привела данные сравнения метода на пластмассовых тарелках с желатиной, на чашках Петри и ускоренного метода с
применением желатины. А. А. Михайлова [36] проводила сравнительную оценку предложенной ею реакции конглютинации в пробирках с 33% полиглюки-ном при комнатной температуре и чашечного метода Н. И. Блинова и Н. С. Дробышевой. Результаты обоих методов были в достаточной степени воспроизводимы.
Имеются данные сравнительной оценки чувствительности методов с 10% желатином, с 33% полиглюкином и антиглобулиновым тестом (Н.В. Минеева, 1991 г. [33]), поликатионного метода выявления антиэритроцитарных антител (Г. В. Скосырев, 1998 [52]), альбуминового метода (С. И. Донское, 1968 [14, 15]), двухэтапной модернизированной пробы с использованием антиглобулина (Н. И. Васильев, 2002 [9]), гелевой технологии (М. Элламаа и соавт., 1998 [63]), ферментных (С. И. Донсков, 1969 [16]; Р. С. Сахаров, 1968 [48]) и других методов выявления антител.
Упомянутые авторы проводили сравнение воспроизводимости и чувствительности разработанных или модифицированных ими методов лишь с некоторыми, отдельно взятыми методами, применяемыми в РФ. В целом же сопоставление одновременно всех используемых в РФ методов, как уже указывалось выше, не проводилось.
Вторым побудительным мотивом, продиктовавшим необходимость проведения настоящей работы, послужили накопленные в литературе последних лет многочисленные данные о различном химическом строении и своеобразии пространственной структуры антиэритроцитарных антител. Указанные особенности антител, по-видимому, обусловливают неодинаковое их клиническое значение, а также неодинаковую возможность детекции тем или иным методом.
Антиэритроцитарные антитела дифференцируются на три основных класса: IgM, IgA, IgG, и несколько субклассов (Furukawa et al., 1991 [89]). Однако не все классы и субклассы иммуноглобулинов способны вызвать in vivo разрушение эритроцитов (Giblett, 1977 [93]; Walker et al., 1989 [191]). Shaw et al. (1988) [170], Lynen et al. (1994) [131] отметили, что в трансфузиологической и акушерской практике имеют значение антитела, относящиеся к классам М и G и суб-

Сравнивали число положительных и отрицательных результатов с числом клеток, экспрессирующих или не экспрессирующих соответствующий антиген. В исследованиях мы использовали для каждого идентифицированного антитела три антигенположительных образца эритроцитов, которые взаимодействуют, и три антигенотрицательных, которые не взаимодействуют с данными антителами.
Определяли активность, специфичность и титр антител, их принадлежность к субклассам и 03.
В последнее десятилетие уделяется большое внимание валидации методов анализа [39, 99]. Нормативных документов, касающихся валидации серологических методов, применяемых в иммуногематологии, нам найти не удалось, поэтому валидация методик проводилась только по двум параметрам.
Под чувствительностью (пределом определения) понимали способность метода детектировать антиэритроцитарные антитела в низком титре. Чувствительность методов оценивали как визуально, по авидности антител, агглютинирующих эритроциты, так и путем микроскопирования при сомнительных или отрицательных результатах. За титр антител принимали максимальное разведение сыворотки, при котором определялась агглютинация эритроцитов к 10 минутам наблюдения.
Воспроизводимость результатов иммуносерологических реакций оценивалась путем двукратного повторения серий исследований с одними и теми же реактивами при одних и тех же рабочих условиях в течение короткого периода времени.
Применяли модификацию желатиновой методики для изучения влияния центрифугирования на степень агглютинации. Для этого до и после 30 минутной инкубации рабочей смеси в термостате при 48-50°С применяли центрифугирование в течение 1 минуты при 2000 об/ мин. (спин-тест).
Для характеристики серологических параметров антиэритроцитарных антител исследовали их способность агглютинировать эритроциты на плоскости в комбинации с фиколл-верографином - конглютинином, способствующим про-