Повышенная устойчивость недифференцированных и опухолевых клеток к повреждающему действию низких температур

• Автор: Райдан Мазен
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 85 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Выделение и культивирование клеток
3.1.1. Выделение и культивирование кератинодитов
3.1.2. Выделение и культивирование стромальных клеток костного мозга (СККМ) крысы
3.1.3. Выделение и культивирование клеток опухоли
ЕНБ саркомы мышей линии ВаІЬ
3.1.4. культивирование клеток линии А43
3.2. Направленная дифференцировка СККМ в адипоцитарном
или остеогенном направлении
3.3. Методы оценки жизнеспособности клеток
3.3.1. Определение жизнеспособности кератинодитов
3.3.2. Фотоколориметрический метод оценки доли
жизнеспособных клеток СККМ до и после их охлаждения
3.4. Исследуемые объекты и режимы их охлаждения
3.4.1. Исследуемые объекты
3.4.2. Охлаждение клеток кожи человека
3.4.3. Охлаждение СККМ крысы и опухолевых клеток
3.5.Иммунофлуоресцентный анализ степени
диффср енциро в ки кер атиноцитов
3.6. Стриппинг многослойного пласта кератинодитов и снятие
клеток базального слоя
3.7. Выделение белков теплового шока
3.8. ЗИБ-злсктрофорез и иммупноблотинг
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Воздействие холода на гетерогенную популяцию кератинодитов..

4.2. Иммунофлюоресцентный анализ гетерогенной
популяции кератиноцитов
4.3. Содержание белка теплового шока Нвр 70 у
дифференцированных и недифференцированных кератиноцитов
4.4. Воздействие низких температур на СККМ до и после их дифференцировки в адипогенном или остеогенном направлениях
4.5. Результаты воздействия низких температур на опухолевые клетки транс формированной линии А
(эпидермоидпая карцинома человека)
4.6. Результаты воздействия низких температур на
опухолевые клетки ЕНБ
5. ОБСУЖДЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
AFP- антифризные белки
BKJI - внутриклеточные кристаллы льда
ВКМ - внеклеточный матрикс
BSA - бычий сывороточный альбумин
СККМ — сгромальные клети костного мозга
CSP - белки холодового шока
HSP - белки теплового шока
ДТТ - дитиотриэтол
ДЛФО - Дерягина-Ландау-Фервея-Овербека
ITS - инсулин, трансферрин, селенит натрия
INA - нуклеаторы льда
К - кератин
КЦ — кератиноциты
КМ - клеточная мембрана
ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота
PBS - фосфатный буфер
SDS - додецилсульфат натрия

3.4.2. Охлаждение клеток кожи человека
Охлаждению подвергали; цельные фрагменты кожи, эпидермис после его отделения от дермы и кератиноциты, выделенные из эпидермиса в виде суспензии или в виде осадка после центрифугирования суспензии. Обработку исследуемых объектов холодом проводили двумя способами: путем прямого воздействия паров жидкого азота на клетки, используя чашки Петри с перфорированными крышками и путем охлаждения чашек Петри с неперфорированными крышками.
Охлаждение объектов проводили парами жидкого азота в камере программного замораживателя (Ice cube 1810, CSYLAB, Австрия) с электронным блоком контроля. Скорость охлаждения до температуры -10, -20 и -30 °С составляла 5 °С/мин, а до -40 °С и ниже до —12 °С/мин.
Для выявления оптимальных температурных режимов испытывали действие следующих низких температур: -10, -20, -30, -40, -50, -60 и -70 °С. К оптимальным температурам относили те, которые подавляли жизнеспособность гетерогенной популяции кератиноцитов, но в то же время не вызывали их полной гибели. Поскольку результат воздействия холодом мог зависеть от длительности экспозиции, соответственно, охлаждение проводили в течение 1, 3, 5 и 10 мин.
Жизнеспособность популяции кератиноцитов после воздействия на них низких температур оценивали по способности клеток к образованию многослойного пласта и времени, необходимого для осуществления этого процесса.
3.4.3. Охлаждение СККМ крысы и опухолевых клеток
Действию охлаждения подвергали СККМ до и после их дифференцировки в адипогенном или остеогенном направлении, опухолевые клетки трансформированной линии А431 и клетки первичной культуры, выделенной из EHS саркомы мыши (Kibbey, 1994). И в том и в другом случае клетки подвергались охлаждению в криоампулах в двух вариантах: в виде суспензии и в виде осадка после центрифугирования суспензии. Количество клеток в каждой криоампуле составляло 60 тыс/мл. Был использован такой же диапазон низких температур, как