Влияние трансплантации мезенхимных стволовых клеток на развитие посттравматических процессов в головном мозге крыс

• Автор: Григорян, Анаит Суреновна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 241 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цели и задачи исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Научная новизна работы

Теоретическое и практическое значение работы

Апробация работы

Объем и структура диссертации

ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Травма головного мозга. Патогенез и последствия
1.2. Терапия пациентов с ТЕМ
1.2.1. Медикаментозные методы терапии пациентов с ТГМ
1.2.2. Клеточная терапия пациентов с ТГМ
1.2.2.1 .Нейротрансплантация
1.2.2.1.1. Трансплантация фетального мозга
1.2.2.1.2. Трансплантация нейральных стволовых клеток
1.2.2.1.3. Трансплантация ЫТ2-клеток
1.2.2.2.Совместная трансплантация различных типов клеток
1.2.2.3.Трансплантация мезенхимных стволовых клеток
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Эксперименты in vitro
2.1.1. Выделение и культивирование МСК
из стромы костного мозга крыс
2.1.2. ИммунофенотипированиеМСК крыс
2.1.3. Окрашивание МСК крыс флуорохромом РКН26
2.2. Эксперименты in vivo
2.2.1. Моделирование ТГМ у крыс и трансплантация- ~
клеточного материала
2.2.2. Фиксация головного мозга
2.2.3. Выявление флуоресцентно меченых МСК
в головном мозге
2.2.4. Гистологическое окрашивание срезов головного мозга
2.2.5. Морфологический анализ срезов головного мозга
2.2.6. Иммуногистохимическое окрашивание срезов головного мозга
2.2.6.1. Стандартное иммуногистохимическое окрашивание
2.2.6.2. Флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание
2.2.7. Морфометрическое исследование срезов головного мозга
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Характеристики МСК крысы in vitro
3.1.1. Иммунофенотипирование МСК крысы
3.1.2. Окрашивание МСК крысы флуорохромом РКН26
3.2. Локализация меченых флуорохромом РКН26 МСК
в мозге при различных методах трансплантации
3.3. Колокализация флуоресцентной метки МСК
и маркеров других клеточных типов в мозге
3.4. Морфологическая характеристика
головного мозга после экспериментальной ТГМ
3.4.1. Морфологическая характеристика,
головного мозга животных из группы негативного контроля

3.4.2. Морфологическая характеристика
головного мозга крысы при введении в пограничную зону травматической полости культуральной среды а-МЕМ
3.4.3. Морфологическая характеристика
головного мозга крысы при трансплантации МСК в пограничную зону травматической полости
3.4.4. Морфологическая характеристика
головного мозга крысы при внутривенном введении МСК
3.4.5. Морфологическая характеристика
головного мозга крысы при сочетанной трансплантации МСК
3.5. Морфометрическое исследование
головного мозга экспериментальных животных
3.5.1. Сравнительная оценка количества
морфологически неизмененных нейронов в пограничной зоне повреждения в соматосенсорной коре головного мозга у животных из разных экспериментальных групп
3.5.2. Сравнительная оценка количества ,
морфологически неизмененных нейронов в миндалевидном теле у животных из разных экспериментальных групп
3.5.3. Сравнительная оценка количества
морфологически неизмененных и поврежденных нейронов в пириформной коре у животных из разных экспериментальных групп
3.5.4. Сравнительная оценка ширины
астроглиального рубца в пограничной зоне повреждения у животных из разных экспериментальных групп
3.5.5. Сравнительная оценка количества
микрососудов в пограничной зоне повреждения у животных из разных экспериментальных групп ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

194 19 6 210 212 214

Список использованных сокращений:
БСА - бычий сывороточный альбумин
ГФКБ - глиальный фибриллярный кислый белок
ГЭБ - гематоэнцефалический барьер
ДМСО - диметилсульфоксид
МСК - мезенхимные стволовые клетки
НСК — нейральные стволовые клетки
СВЗ - субвентрикулярная зона
СК - стволовые клетки
ТГМ - травма головного мозга
ФБС - фетальная бычья сыворотка
ФСБ — фосфатно-солевой буфер
ФСК - фетальные стволовые клетки
ЦНС - центральная нервная система
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭСК - эмбриональные стволовые клетки
BDNF - brain-derived neurotrophic factor; мозговой нейротрофический фактор bFGF - basic fibroblast growth factor; основной фактор роста фибробластов ■
CD - cluster of differentiation; кластер дифференцировки
EGF - epidermal growth factor; эпидермальный фактор роста
GAP-43 - growth associated protein-43; белок, ассоциированный с ростом-
GDNF - glia-derived growth factor; фактор роста глии
HGF - hepatocyte growth factor; фактор роста гепатоцитов
IGF-1 - insulin-like growth factor-1; инсулиноподобный фактор роста-
IL - interleukine; интерлейкин
LNGF - low affinity nerve growth factor receptor; рецептор низкой) аффинности фактору роста нервов
МАР-2 - microtubule associated protein-2; белок, ассоциированный микротрубочками-

переносили в раствор моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромом, в разведении 1:20. Далее клетки промывали два раза раствором ФСБ и анализировали на проточном цитофлуориметре.
Иммунофенотипирование проводили после первого, второго и третьего пассажей культуры.
2.1.3. Окрашивание МСК крыс флуорохромом РКН
Для окрашивания флуорохромом РКН26 использовались МСК крыс после второго пассажа культуры. Клетки наращивали до плотного монослоя, далее в среду культивирования добавляли витальный липофильный краситель РКН26 (Sigma, США) в конечной концентрации 1мкг/мл. В среде с добавлением красителя клетки культивировали не менее 2 суток. Затем- клетки промывали раствором ФСБ и культивировали в среде без РКН26 не менее 4 часов. Окрашенные МСК снимали с чашек раствором трипсина и ЭДТА и центрифугировали при 1500 об/мин в. течение 10 мин. Полученный осадок дважды промывали ФСБ и суспендировали в питательной среде без сыворотки

(аМЕМ, содержащая 100' мкг/мл пенициллина/стрептомицина) с финальной концентрацией 5х106 клеток в 100 мкл. Эффективность окрашивания- МСК оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope (Zeiss, Германия).
2.2. Эксперименты //!, vivo
2.2.1. Моделирование ТГМ'у крыс и трансплантация клеточного материала
Была смоделирована закрытая травма головного мозга крысы в области, соматосенсорной коры левого полушария (рис.1). Крыс наркотизировали золетилом в дозе 5мг/кг (Virbac Santé Animale, Франция). Во время операции и до выхода из наркоза температура тела животных поддерживалась на уровне 37°С. Голову животного фиксировали, после чего разрезали кожу на голове и вскрывали череп, не повреждая твердой мозговой оболочки, и наносили травму с помощью метода «weight-drop» [75, 172] падением округлой гири весом 1,3 г по направляющей трубочке с высоты 25 см. Импульс удара гири о твердую мозговую