Расшифровка структур геномов как основа изучения особенностей метаболизма, путей эволюции и биоразнообразия архей

• Автор: Марданов, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 311 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1. Термоацидофильная кренархея АасЫоЫи ьасскагоуогапх представитель новой филогенетической линии кренархей
Глава 2. Органотрофные кренархей порядков ОезШ/игососса/ез и ГеплТйсосш/е«
Глава 3. Геномы трех кренархей порядка ТЬегторгсЯеаЦв
Глава 4 Лгеппо/йит сагЬохуйо1гор1шх, карбоксидотрофная кренархея порядка 1Ьегторго1еа1е5
Глава 5. Эуриархея Пегтососсш х1Ыг1си.\ выделенная из пластоых вод нефтяного резервуара
Глава 6. Молекулярный анализ микробных сообществ термальных источников Камчатки
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ литературы

ВВЕДЕНИЕ
С момента описания Карлом Возе в качестве отдельного, наряду с бактериями и эукариотами, домена живых существ (Woese and Fox, 1977), археи стали одними из наиболее интересных объектов микробиологии, молекулярной биологии и биохимии. Длительное время наиболее известной группой архей были метаногены, широко распространенные в различных анаэробных местах обитания. Другие археи рассматривались как «экстремофилы», обитающие в специфических экологических нишах, в которых не могут развиваться другие организмы - при высоких температурах (термофилы), в кислых или щелочных условиях (ацидофилы и алкалофилы), при высокой солености (галофилы). Термофильные археи были обнаружены в горячих источниках Йеллоустонского парка США, Исландии, Камчатки, Новой Зеландии и т.д. Среди архей были выделены микроорганизмы, живущие при экстремальных значениях одновременно и температуры и pH - термоацидофилы и термоалкалифилы (Schleper et al., 1995; Li et al., 1993). Археи были найдены в глубоководных гидротермальных источниках на глубинах более 1000 м, где вода остается жидкой даже при температуре, значительно превышающей 100°С. В результате этих исследований были выделены микроорганизмы, способные расти при температуре 115°С (Blochl et al., 1997) и даже 121 °С (Kashefi and Lovely 2003). Работы последних двух десятилетий, в первую очередь связанные с анализом последовательностей генов рибосомных 16S РНК, выделенных непосредственно из природных источников, показали, что археи распространены глобально и встречаются в почвах (Bintrimet al., 1997; Ochsenreiter et al., 2003; Galand et al., 2005), морской воде (DeLong, 1992; Fuhrman et al., 1992) и донных осадках (Boetius et al., 2000; Orphan et al., 2001; Mills et al., 2005), пресных водоемах (MacGregor et al., 1997; Keough et al., 2003), глубинных подземных местообитаниях (Takai et al., 2001), кишечнике человека (Lepp et al., 2004). Во многих местообитаниях археи являются важными компонентами сообществ, например, в мировом океане их доля оценивается в 10-40% всех микроорганизмов (Karner et al., 2001). Широкое распространение и многочисленность архей в различных морских и наземных экологических нишах свидетельствует о том, что не только метаногены, но и другие группы архей могут играть ключевую роль в глобальных биогеохимических процессах (Könneke et al., 2005; Leininger et al., 2006).
Несмотря на большой интерес к археям, успехи в изучении их молекулярной биологии, эволюции и метаболизма до середины 1990-х годов были весьма ограничены. Это во многом связано со сложностью культивирования большинства этих микроорганизмов и практически полным отсутствием генетических «инструментов»

(генетическая трансформация, векторы для экспрессии, методы нокаута генов и др.), подобных давно разработанным для таких модельных объектов как бактерии Escherichia coli. Многие эволюционно древние линии архей, известные по последовательностям 16S рРНК из природных источников, до настоящего времени не имеют представителей, культивируемых в лабораторных условиях, и остаются практически не изученными.
Поэтому успехи в развитии геномики, вызвавшие в середине 1990-х годов «геномную революцию» в микробиологии, вносят особенно заметный вклад в исследование архей. Хотя ключевое место в геномике микроорганизмов первоначально занимали «медицинские» объекты - возбудители наиболее значимых заболеваний человека, организмы, представляющие интерес для биотехнологии, экологии и эволюционных исследований также быстро стали объектами геномных проектов. Так, архея Methanococcus jannaschii стала третьим по счету организмом, для которого была определена полная нуклеотидная последовательность генома (Bult et al., 1996). Роль расшифровки генома в изучении М. jannaschii хорошо иллюстрируется числом соответствующих публикаций, - 13 представленных в Pubmed работ за период от открытия этой архей в 1983г. до расшифровки ее генома в 1996г. и более пятисот работ, опубликованных за последующие 15 лет.
Благодаря быстрому развитию геномных технологий растет число полных геномных последовательностей, расширяются наши знания о биологии архей, их разнообразии и эволюции (Gribaldo and Broichier-Armanet, 2006). Получены новые данные об эволюции ключевых генетических процессов у архей, таких как клеточное деление и репликация ДНК, роли горизонтального переноса генов в эволюции архей, выявлены новые взаимосвязи между археями и эукариотами.
Основные пути метаболизма у архей и соответствующие ферменты сходны с бактериальными, в то время как аппарат репликации и экспрессии генетической информации более близок к эукариотическому. Вследствие этого архей являются удобными модельными объектами для изучения молекулярных механизмов и эволюции многих генетических процессов у эукариот.
На момент начала данной работы, 2008г., было просеквенировано всего около 50 полных геномов архей (в настоящее время известно около 100 геномов), что более чем на порядок меньше, чем число расшифрованных бактериальных геномов. Как отмечалось выше, даже культивирование большинства архей является непростой задачей, поэтому большинство из 50 архей с известными полными геномными последовательностями представляли всего несколько филогенетических групп, -

2009). Например, такие предположительно эволюционно древние характеристики, как «расщепленные» гены тРНК, образующихся в результате транс-сплайсинга (Di Guilio, 2007) были позднее обнаружены у кренархеи Caldivirga maquilingensis (Fujishima et al„ 2009).
Еще одна группа архей, имеющих минимальный размер клеток (диаметром менее 500 нм), была идентифицирована в качестве минорного компонента в биопленках, развивающихся в шахтных водах, характеризующихся высокой кислотностью и содержанием металлов (Richmond Mine, Калифорния, США). Эти археи живут совместно с эуриархеями порядка Thermoplasmatales. Вскоре после описания этой группы, названной ARMAN (Baker et al., 2006), в результате секвенирования метагеномов микробных матов были получены почти полные геномы трех ее представителей, названных Parvarchaeum acidiphilum, Parvarchaeum acidophilus и Micrarchaeum acidiphilum (Baker et al., 2010). Размеры геномов составляли около 1 MB, геномы характеризовались высоким АТ составом и наличием «расщепленных» генов, что характерно для симбиотических микроорганизмов (Baker et al., 2010). Особенностями геномов архей линии ARMAN, отражающими эволюционное давление в направлении уменьшения размера генома, являются более высокая по сравнению с другими археями доля кодирующих последовательностей в геноме, меньшая средняя длина гена и наличие значительного числа перекрывающихся генов. Филогенетический анализ последовательностей рибосомных белков показал, что ARMAN являются отдельной линией в типе Euryarchaeota (Рис. 5).
Археи с небольшим размером клеток и генома были недавно обнаружены и среди галофилов порядка Halobactertiales. Геномные последовательности двух таких микроорганизмов из соленого озера Тирелл в Австралии были определены в результате секвенирования метагенома образца воды озера, содержащего фракцию клеток размером 0.1-0.8 мкм (Harasingarao et al., 2012). Филогенетический анализ последовательностей рибосомных белков показал, что эти «наногалоархеи», названные ‘Candidatus Nanosalina sp. J07AB43’ и ‘Candidatus Nanosalinarum sp. J07AB56’, образуют отдельную филогенетическую ветвь у основания порядка Halobactertiales. Об изолированности этой линии также свидетельствует то, что около 60% всех предсказанных белков наногалоархей не имело гомологов в GenBank. Анализ геномных последовательностей указывает на то, что эти организмы являются аэробными гетеротрофами, не способными к анаэробному дыханию. Их характерными особенностями являются небольшой размер генома (около 1.2 MB) с низким GC составом, отсутствие характерных для галоархей газовых вакуолей и необычные пути