Дальнекрасные флуоресцентные белки

• Автор: Щербо, Дмитрий Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Содержание
Введение
Список сокращений
1. Обзор литературы
1.1. Структура и свойства БРР-подобньїх белков
1.1.1 Семейство СРР-подобных белков
1.1.2 Структура и свойства СРР-подобных белков
1.1.2.1 Хромофорные группы
1.1.2.2 Олигомерный статус
1.1.3 Цветовое разнообразие СРР-подобных белков
1.2. Применение бРР-подобньїх белков
1.2.1 Мониторинг экспрессии генов
1.2.2 Изучение локализации и перемещения белков
1.2.3 Внутриклеточные индикаторы [биосенсоры]
1.3. Визуализация в лабораторных животных
1.3.1 Обзор методов визуализации
1.3.2 Оптические флуоресцентные методы визуализации
1.3.3 Использование флуоресцентных белков для ШВІ
2. Материалы и методы
2.1. Объекты исследования
2.2. Оборудование и реактивы
2.2.1 Оборудование
2.2.2 Реактивы
2.2.3 Буферные растворы
2.2.4 Микробиологические среды
2.2.5 Бактериальные штаммы и клеточные линии
2.3. Методы исследования и анализа данных
2.3.1 Амплификация фрагментов ДНК

2.3.2 Сайт-специфичный ПЦР-мутагенез
2.3.3 Случайный ПЦР-мутагенез
2.3.4 Трансформация клеток E. coli
2.3.5 Выделение плазмидной ДНК
2.3.6 Выделение и очистка рекомбинантных белков
2.3.7 Спектроскопия
2.3.8 Трансфекция эукариотических клеток
2.3.9 Микроскопия
2.3.10 Гель-фильтрация
2.3.11 Отбор нетоксичных вариантов белков в E. coli
2.3.12 Получение рекомбинантных генетических конструкций
2.3.12.1 Получение прокариотических эксперссионных векторов
2.3.12.2 Получение эукариотических экспрессионных векторов
2.3.12.3 Получение библиотеки кДНК Entacmaea quadricolor
2.3.12.4 Получение TurboRFP
2.3.12.5 Получение TagRFP
2.3.12.6 Получение Katushka
2.3.12.7 Получение mKate
2.3.12.8 Получение mKate
2.3.12.9 Получение tdKatushka
2.3.12.10 Получение eqFP650 и eqFP
2.3.13 Трансгенные Xenopus laevis
2.3.14 Визуализация в мышах
3. Результаты и обсуждение
3.1. Получение ярких красных флуоресцентных белков
3.1.1 Получение белков TurboRFP и TagRFP
3.1.2 Характеристика белков TurboRFP и TagRFP
3.2. Получение дальнекрасных флуоресцентных белков
3.2.1 Получение белков Katushka и mKate
3.2.2 Характеристика белков Katushka и mKate

3.2.2.1 Характеристика и сравнение с аналогами in vitro
3.2.2.2 Характеристика и сравнение с аналогами in vivo
3.2.3 Получение белков mKate2 и tdKatushka
3.2.4 Характеристика белков tdKatushka2 и mKate
3.2.4.1 Характеристика и сравнение с аналогами in vitro
3.2.4.2 Характеристика и сравнение с аналогами in vivo
3.3. Получение околоинфракрасных флуоресцентных белков
3.3.1 Получение белков eqFP650 и eqFP
3.3.2 Характеристика белков eqFP650 и eqFP
3.3.2.1 Характеристика и сравнение с аналогами in vitro.
3.3.2.2 Характеристика и сравнение с аналогами in vivo..
3.4. Заключение
4. Выводы
Список литературы
определенных задач. Принцип локализационной микроскопии, основанной на фотоактивации [photo-activated localization microscopy, PALM] заключается в последовательном и статистически случайном фотопереключении пула фотоактивируемых проб в образце с использованием света, обладающего недостаточной интенсивностью для единомоментной активации всех молекул. В процессе съёмки происходит накопление набора изображений, содержащих сигнал от отдельных флуорофоров, за счёт повторения циклов фотоактивации и фотообесцвечивания. Впоследствии эти изображения обрабатываются с помощью специального математического аппарата'таким образом, что каждая молекула может быть локализована с высокой точностью благодаря определению точки, из которой испускается флуоресценция. В лучших подобных системах точность позиционирования достигает 10 нм.
Методы низкого разрешения'
Визуализация объектов в целых организмах осуществляется с помощью методов низкого разрешения - диффузной флуоресцентной томографии (diffuse optical tomography, DOT], метода проекций и наблюдения в отражённом свете.
Метод диффузной оптической томографии (рис. 7 г] основан на детекции света, проходящего через ткани, с использованием матрицы источников и детекторов, свойствами которой- и определяется пространственное разрешение метода (миллиметры]. Для получения трёхмерных изображений объектов с хорошим пространственным разрешением (5-10 мкм] применяется оптическая проекционная томография, основанная на детекции прохождения видимого света (400-700 нм] через вращающийся на 360° образец [99]. Метод проекций позволяет визаулизировать как близкие к поверхности так и глубоко расположенные объекты (рис. 7 в].