Влияние точечной мутации D112R на рекомбинационную активность белка RecA из Escherichia coli

• Автор: Дудкина, Александра Валентиновна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 118 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Бактериальная конъюгация

1.2. Гомологическая рекомбинация у бактерий

1.3. Центральная роль белка RecA в гомологической рекомбинации

1.4. Частота рекомбинационных обменов на единицу длины ДНК

1.5. Роль белка RecA в SOS-системе клетки

1.6. Структурно-функциональные особенности белка RecA

1.7. Взаимодействие белка RecA с онДНК

1.8. Взаимодействие белка RecA с днДНК
1.9. Гидролиз АТФ
1.10. Реакция переноса нити ДНК
1.11. Роль белка SSB в реакции переноса нити ДНК
1.12. Белки, влияющие на функции RecA
1.13. Единичные замены в области межпротомерного взаимодействия белка RecA из Е.
coli
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Среды
2.3. Манипуляции с ДНК
2.4. Рекомбинационный тест
2.5. Определение частоты рекомбинационных обменов
2.6. SOS-хромотест
2.7. Ферменты и реактивы

2.9. Трансформация компетентных клеток пламидной ДНК
2.10. Метод иммуноблоттинга
2.11. Подготовка хроматографических носителей к выделению белков
2.12. Выделение и очистка белков
2.13. Реакции, катализируемые белком RecA
2.14. Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Исследование рекомбинационных свойств мутантных белков КесА с точечными
аминокислотными заменами в области мономер-мономерного взаимодействия
3.2. Определение конститутивной экспрессии 808-функции
3.3. Подавление гиперрекомбиназной активности популяции клеток в ходе их
культивирования в жидкой ростовой среде
3.4. Изучение биохимических свойств белка КесА В112Я
3.4.1 Очистка белка ЯесА П> 11217 и измерение его АТФазной активности
3.4.2. Расплавление вторичных структур на онДНК фага М13 белком Ясс Л I) 112 Я
3.4.3. Вытеснение белком ЯесА Б112Я белка БвВ с кольцевой онДНК
3.4.4. Влияние белка КесА В112К на автокаталитическое расщепление белка ЬехА
3.4.5. Влияние негативных регуляторов Ря1В и КесХ на АТФазную активность белка КесА

3.4.6. Влияние мутации 0112Я на взаимодействие КесА с белками вЭВ и ЯесХ
3.4.7. Реакция переноса нити, проводимая белком ЯесА В112Я
3.4.8. Повышенная синаптазная активность белка ЯесА В11211
Глава 4. Заключение
Глава 5. Выводы
Список публикаций по теме диссертации
Список литературы
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.к. — аминокислота АП — аминопсптид АТФ — аденозинтрифосфат
АТФуБ - аденозин-5'-0-(3-тиотрифосфат), слабо гидролизуемый аналог АТФ
АДФ-А1Р4 — аденозин-5'-0-А1р4, негидролизуемый аналог АТФ
ГР — гомологическая рекомбинация
ГТФ - гуанозинтрифосфат
дАТФ - дезоксиаденозин-5'-0-(3-тиотрифосфат)
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
днДНК — двунитевая ДНК
дУТФ - дезоксиуридин-5'-0-(3-тиотрифосфат)
ДЦТФ - дезоксицитидин-5 '-О-(З-тиотрифосфат)
ИТФ — инозинтрифосфат
кп - конечный продукт реакции переноса нити (кольцевая никированная днДНК) н. — нуклеотид
ом - объединенные молекулы, интермедиаты (в реакции переноса нити)
онДНК - однонитевая ДНК
ОНФГ - о-нитрофенил-Р-О-галактозид
п.н. - пара нуклеотидов
ПТФ - пуринтрифосфат
СХ - соединение Холидея
тнДНК - триплексная ДНК
т.п.н. — тысяча пар нуклеотидов
УТФ - уридинтрифосфат
УФ - ультрафиолет
ЦТФ - цитидинтрифосфат
AMPPNP - аденилимидодифосфат
DTT — дитиотрейтол
E. coli - бактерии вида Escherichia coli
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
IPTG - ИПТГ - изопропил-р-Э-тиогалактозид
JM — joint molecule - сцепленная молекула ДНК, интермедиат

очередь, связано с гидролизом АТФ. Поскольку на шаг спирали филамента приходится 6 мономеров RecA, гидролиз АТФ одним мономером приводит к повороту на 60°. Так как на шаг спирали ДНК в составе филамента RecA приходится 18 пар нуклеотидов (п.н.), каждое полное вращение приведет к миграции ветви на 18 п.н. Однонаправленное вращение, очевидно, приводит к однонаправленной реакции переноса. Эта модель так же легко объясняет преодоление структурных препятствий в ДНК: продолжительное вращение обмениваемых ДНК субстратов в точке барьера приводит к раскручиванию ДНК в этом месте.
Ротационная модель позволяет оценить эффективность образования гибридной ДНК в реакции переноса нити. Поскольку типичный филамент RecA содержит около 2000 мономеров, гидролиз АТФ каждым мономером в составе филамента приведет к повороту на 360° и миграции ветви на 18 п. н., что соответствует 100 гидролизованным молекулам АТФ на каждую п. н. образованного гетеродуплекса.
Из ротационной модели следует, что если гидролиз АТФ связан с вращением ДНК, скорость переноса нити должна зависеть от скорости гидролиза АТФ, что подтверждается экспериментально (Nayak and Bryant, 1999).
1.10. Реакции переноса нити ДНК
Основным этапом ГР является реакция переноса нити между гомологичными днДНК и онДНК, катализируемая белком RecA. В типичной реакция переноса нитей ДНК, используемой для изучения функций RecA in vitro, можно выделить, как минимум, три основных стадии (Рисунок 1.4) (Kowalczykowski et al, 1994; Kowalczykowski and Eggleston, 1994; Roca andCox, 1997; Lusetli and Cox, 2002; Cox, 2003):
1) образование пресинаптического комплекса;
2) синаптическая стадия;
3) элонгация гегеродуплексной ДНК и образование продуктов реакции.
Первая стадия - образование пресинаптического комплекса, включает в себя мульгимеризацию белка RecA на кольцевой онДНК в присутствии АТФ и ионов Mg2+. Препятствием к образованию протяженного филамента служат вторичные структуры на онДНК, которые могут быть разрушены онДНК-связывающим белком SSB. Белок RecA, мультимеризуясь вдоль онДНК в 5'—>3' направлении, вытесняет белок SSB и создает достаточно протяженный филамент, в котором один мономер RecA приходится на 3-4 нуклеотида, а вся онДНК расположена в первичном сайте (Roca and Сох, 1997). Необходимость белка SSB на этой стадии отпадает при значительном снижении