Влияние малой ГТФазы Rac1 на взаимодействие виментиновых промежуточных филаментов с митохондриями

• Автор: Зеркаленкова, Елена Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура и функции митохондрий

1.1.1. Общее строение митохондрий

1.1.2. Потенциал митохондрий и синтез АТФ

1.1.3. Митохондриальные красители

1.1.4. Регуляция концентрации ионов Са2+ митохондриями

1.1.5. Транспорт в митохондрию

1.1.6. Генерация активных форм кислорода

1.1.7. Динамика и подвижность митохондрий

1.2. Промежуточные филаменты (ПФ)
1.2.1. Строение ПФ
1.2.2. Сборка ПФ
1.2.2.1. Формирование димеров
1.2.2.2. Формирование тетрамеров
1.2.2.3. Формирование протофиламентов единичной длины и дальнейшие этапы сборки
1.2.3. Динамика ПФ в клетке
1.2.4. Фосфорилирование белков ПФ
1.2.4.1. Фосфорилирование ПФ in vitro
1.2.4.2. Фосфорилирование ПФ in vivo
1.2.5. Функции виментина. Болезни, связанные с ПФ
1.3. Белок Racl и его эффектор протеинкиназа РАК
1.3.1. Белок Racl
1.3.1.1. Строение белка Racl
1.3.1.2. Подходы к изучению функций белка Racl
1.3.2. Функции белка Racl
1.3.2.1. Регуляция концентрации АФК белком Racl
1.3.2.2. Регуляция динамики цитоскелета белком Racl
1.3.3. Эффектор белка Racl - протеинкиназа РАК
1.3.3.1. Строение протеинкиназы РАК
1.3.3.2. Регуляция киназной активности РАК
1.3.3.3. Функции протеинкиназы РАК
1.4. Перестройки цитоскелета как способ регуляции функционального состояния митохондрий
1.4.1. Влияние цитоскелета на распределение и функционирование митохондрий
1.4.2. Роль функционального состояния митохондрий в физиологии клетки. Цитотоксические препараты
1.4.3. Модель механизма регуляции взаимодействия митохондрий с цитоскелетом
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клеточные линии и культивирование клеток
2.2. Трансфекция клеток
2.3. ДНК-конструкции
2.3.1. Конструкции, кодирующие различные формы белка Racl
2.3.2. Конструкции, кодирующие различные формы виментина
2.3.3. Конструкции, кодирующие различные формы протеинкиназы РАК
2.4. Окрашивание клеток митохондриальными потенциалзависимыми красителями
2.5. Иммунофлуоресцентное окрашивание
2.5.1. Фиксация клеток
2.5.2. Иммунофлуоресцентное окрашивание
2.5.3. Антитела к виментину и окраска актиновых микрофиламентов
2.6. Микроскопия
2.6.1. Методика проведения микроскопии живых и зафиксированных клеток
2.6.2. Анализ относительной подвижности митохондрий
2.6.3. Определение трансмембранного потенциала митохондрий
2.7. Получение линий клеток, стабильно экспрессирующих различные типы виментина
2.8. Определение устойчивости клеток к цитотоксическим препаратам
2.8.1. МТТ-тест
2.8.2. Тест с нейтральным красным
2.8.3. Построение кривых выживаемости
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Влияние Racl на подвижность и трансмембранный потенциал митохондрий
3.1.1. Сравнение относительной подвижности митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин, в присутствии мутантных форм белка Racl
3.1.2. Влияние мутантных форм белка Racl на относительную подвижность митохондрий в клетках с восстановленным виментином
3.1.3. Кинетика относительной подвижности митохондрий в клетках, экспрессирующих Racl-LOV
3.1.4. Влияние Racl на трансмембранный потенциал митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин
3.2. Поиск эффектора белка Racl в регуляции подвижности митохондрий
3.3. Проверка участия протеинкиназы РАК1 в регуляции подвижности и трансмембранного потенциала митохондрий
3.3.1. Влияние каталитического домена РАЮ на подвижность митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин
3.3.2. Влияние аутоингибиторного домена РАЮ на эффект Racl в регуляции подвижности митохондрий
3.3.3. Влияние аутоингибиторного домена РАЮ на эффект Racl в регуляции трансмембранного потенциала митохондрий
3.4. Изучение роли остатка серина-55 виментина в регуляции взаимодействия митохондрий с виментином
клетках, одновременно экспрессирующих кератин и виментин, длинные кератиновые филаменты двигаются в 3 раза медленнее виментиновых (0,06 мкм/мин), а кератиновые субъединицы в 15 раз медленнее виментиновых субъединиц. Кроме того, транспорт кератиновых субъединиц в основном направлен к ядру (84%). Причина этих различий кроется том, что большая часть кератиновых субъединиц ассоциирована с сетью актиновых микрофиламентов и перемещается с помощью миозина. Виментин же, как уже было упомянуто, перемещается в основном по микротрубочкам (Helfand et al., 2004).
Особый интерес представляет формирование системы ПФ в нейронах. Субъединицы нейрофиламентов перемещаются вдоль аксона со скоростью, равной 1,8 мкм/сек (Roy et al., 2000), так как они транспортируются по микротрубочкам при помощи кинезина и динеина. Движение этих структур прерывается долгими паузами, так что двигаются они только 27% времени, а в зрелых сенсорных аксонах нейрофиламенты находятся в покое около 99% времени (Brown, 2000).
Итак, ПФ проявляют большую подвижность внутри клетки. Они взаимодействуют с моторными белками и IFAP, которые, в свою очередь, помогают им в распределении и формировании внутриклеточных сетей ПФ. Вместе с тем несомненно, что и сборка-разборка, и транспорт, и взаимодействие ПФ с другими органеллами находятся под регуляторным контролем внешних и внутренних факторов и могут модулироваться, прежде всего за счет фосфорилирования.
1.2.4. Фосфорилирование белков ПФ
Одним из наиболее хорошо изученных способов регуляции структуры, динамики и взаимодействия ПФ с другими органеллами клетки является фосфорилирование различными протеинкиназами. Как уже было упомянуто выше, сосредоточение большого числа сайтов фосфорилирования в N-концевом домене виментина косвенно указывает на важность этого домена и этой поспрансляционной модификации для сборки и стабильности филаментов, а