Анализ трансренальной ДНК как новый подход к диагностике злокачественных новообразований

• Автор: Ботезату, Ирина Викторовна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Генетическая и эпигенетическая составляющие канцерогенеза
1.2. Маркеры - наиболее типичные генетические дефекты
1.3. Белки-маркеры и ДНК-маркеры: сопоставление
1.4. Циркуляция ДНК в организме
1.5. Клинические объекты и цели
1.6. Практические применения и специфические проблемы
1.7. ДНК-маркеры и возможности скрининга
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Эксперименты на лабораторных животных
2.2. Клинические эксперименты
2.3. Молекулярные методы
Детекция Y-специфических последовательностей (стандартная и «гнездная» ПТТР)
Детекция микросателлитных последовательностей Детекция мутаций К-ТМУ методом RFLP («обогащенная» ПЦР)
Детекция мутаций K-RAS методом SSCP
Детекция мутаций К-RAS методом секвенирования по
Сэнгеру
Метод гибридизации-элонгации фрагментов ДНК Плавление ДНК: «закрытый» и «открытый» формат Пост-амплификационная оптимизация условий плавления ДНК
Иммобилизация полинуклеотидов на магнитных гранулах Плавление ДНК в режиме высокого разрешения (HRMA)
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Обнаружение трансренальной ДНК
3.1.1. ДНК преодолевает почечный барьер грызунов
3.1.2. ДНК преодолевает почечный барьер человека
3.2. Трансреналыгая ДНК как объект генодиагностики
3.2.1. Анализ микросателлитных последовательностей
3.2.2. Выявление мутаций К-RAS в трансренальной ДНК
3.3. Разработка новых методических приемов
3.3.1. Шаблон-опосредованная ПНР
3.3.2. Метод гибридизации-элонгации фрагментов ДНК
3.3.3 Сканирование мутаций методом плавления ДНК:
применение «открытого формата»
Переменные, влияющие на плавление ДНК Размер ампликона и позиция неспаренного основания Сканирование мутаций К-RAS («открытый формат»)
Сопоставление приборов 105 и С1-Х96
3.3.4. Мутации К-КАБ в ДНК клинических образцов: сопоставление методов обнаружения
4. ОБСУЖДЕНИЕ
Трансренальная ДНК как разновидность циркулирующей
Мутации в ДНК опухоли и в циркулирующей ДНК Методические проблемы и пути их преодоления ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:
гитц - гуанидинизотиоцианат
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
кДа - килодальтон
к ДНК - комплементарная ДНК
ЛЦР - лигазная цепная реакция
миРНК - микроРНК
мкг - микрограмм
мкл - микролитр
мРНК - информационная РНК
нг - нанограмм
ОТ-ПЦР — обратная транскрипция—полимеразная цепная реакция
ПААГ - полиакриламидный гель
П.О. - пара оснований
ПЦР — полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени
РНК - рибонуклеиновая кислота
т.п.о. - тысячи пар оснований
УЗИ - ультразвуковое исследование
УФ - ультрафиолет
С - threshold cycle (пороговый цикл в ПЦР в реальном
времени)
dNTP - deoxyribonucleotide triphosphates
(дезоксирибонуклеозидтрифосфаты)
HRMA - high resolution melting analysis (анализ плавления ДНК в
режиме высокого разрешения)
LOH - Loss of Heterozygocity (потеря гетерозиготности)
MASA - mutant allele specific amplification (специфическая
амплификация мутантного аллеля)

среды, содержащей 5 мкл ДНК, 67 мМ Трис-НС1, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2S04, 0,01% Твин-20, 1,5 мМ MgCl2, по 0,2 мМ каждого из dNTP, 0,5 мкМ каждого из праймеров и 2 ед Та-полимеразы. Для «гнездного» варианта ПЦР 3 мкл первой реакционной среды вносили в 30-мкл объем второй (на первом и втором этапах проводили, соответственно, 35 и 25 циклов). Условия ПЦР: денатурация - 94°С 20 с; отжиг - 58°С 30 с; элонгация - 72°С 30 с. ПЦР проводили на амплификаторе Eppendorf MasterCycler (Германия).
С целью минимизации загрязнения инкубационных смесей продуктами ПЦР, что представляет собой серьезную проблему в подобных исследованиях, их (до внесения ДНК) обрабатывали рестриктазами Haelll и ЕсоШ (5 ед на 30 мкл реакционной среды, 3 ч при 37°С), имеющими в соответствующем ампликоне сайты рестрикции, после чего пробы прогревали 5 мин при 94°С и лишь затем вносили ДНК и инициировали процесс амплификации. Для контроля возможного загрязнения использовали солевой раствор, прошедший все этапы анализа.
Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 10% ПААГ.
Детекция микросателлитных последовательностей. Методом ПНР анализировали шесть полиморфных микросателлитных локусов, содержащих блоки (САД динуклеотидов. Праймеры подбирали таким образом, чтобы длина ампликонов не превышала 180 п.о. Названия локусов и последовательности праймеров приведены ниже:
D2S123: 5’-acattgctggaagttctggc и 5’-ctttctgacttggatacca Dl 1S900: 5’-ctatgccctcattaaaaccc и 5’-gtcgcatctgtacaatctgg D18S58: 5’-gctcccggctggtttt и 5’-gcaggaaatcgcaggaactt Dl OS 197: 5 ’-accactgcacttcaggtgac и 5’-gtgatactgtcctcaggtctcc DBS 175: 5’-tattggatacttgaatctgctg и 5’-tgcatcacctcacataggtta D3S1284: 5’-gccttgggggtaaatactct и 5’-ggaattacaggccactgctc
ПЦР проводили в объеме 20 мкл в смеси стандартного состава (см. выше).
В реакционную смесь добавляли 30-50 нг ДНК, выделенной из нормальной или