Молекулярно-генетические подходы к получению ферментных препаратов карбогидраз с улучшенными гидролитическими свойствами

• Автор: Волков, Павел Валерьевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Состав и строение растительной клеточной стенки
1.1. Основные компоненты растительной клеточной стенки
1.2. Целлюлоза
1.3. Нецеллюлозные /1 - глюканы
1.4. Гемицеллюлозы и пектины
1.5. Пектины
Г лава 2. Инулин - строение и свойства
Г лава 3. Свойства и структура целлюлаз и инулиназ
3.1. Общие представления о целлюлолитических ферментах и их классификации 20 3.2.Особенности строения и биохимические параметры целлюлолитических

ферментов
3.3. Свойства инулиназ из различных микроорганизмов
Глава 4. Механизм ферментативной деградации целлюлозы и инулина
4.1. Механизм действия целлюлазного комплекса
4.2. Синергизм действия целлюлолитических ферментов на субстрат
4.3 Механизм гидролиза инулосодержащего сырья
Глава 5. Применение целлюлаз и инулиназ в биотехнологии
Глава 6. Возможности использования штамма Р.саиелсега для получения

ферментных препаратов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 7. Материалы и методы экспериментов
7.1. Ферментные препараты
7.2. Субстраты
7.3. Прочие реактивы

7.4. Хроматографические сорбенты
7.5. Проведение полимеразной цепной реакции и получение генетических конструкций
7.6. Получение протопластов и проведение трансформации штамма-реципиента
Рcanescens
7.7. Культивирование трансформантов Р.сапевсет в 3-л ферментёрах
7.8. Определение концентрации белка
7.9. Определение биохимических характеристик ферментов
7.10. Методы определения активности ферментов
7.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков
7.12. Определение температурного и рН-оптимума действия ферментов
7.13. Изучение термостабильности ферментов
7.14. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов гидролиза целлюлозо- и инулосодержащего сырья
7.15. Хроматографическое фракционирование ферментных препаратов Р.сапезсет'
7.16. Гидролиз целлюлозосодержащих субстратов
7.17. Гидролиз инулосодержащих субстратов
7.18. Определение кинетических параметров действия ферментов (Кт, Кса!)
7.19. Изучение влияния эффекторов на активность ферментов
7.20. Анализ молекулярно-массового распределения (ММР) продуктов гидролиза инулина
7.21. Окрашивание агаризованной среды с КМЦ конго-красным РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 8. Получение ферментных препаратов целлюлаз на основе рекомбинантных штаммов Р. сапейсет
8.1. Выделение генов и создание экспрессионных конструкций
8.2. Первичный скрининг полученных трансформантов
Глава 9. Свойства новых ферментных препаратов, полученных на основе рекомбинантных штаммов Рcamscens

9.1. Анализ ферментных препаратов с помощью методов электрофореза и изоэлектрофокусирования
9.2. Субстратная специфичность исследуемых ферментных препаратов
9.3. pH- и температурные оптимумы активности ферментных препаратов, стабильность использованных ферментных препаратов.
Глава 10. Ферментативный гидролиз микрокристаллической целлюлозы и измельчённой осиновой древесины ферментными препаратами P.canescens
10.1 Результаты гидролиза МКЦ ФП ЦБГ1, ЦБГП и ЭГИ
10.2 Результаты гидролиза микрокристаллической целлюлозы смесью ФП ЦБП и ЭГП-6.
10.3 Результаты гидролиза микрокристаллической целлюлозы смесью ФП ЦБГН и ЭГИ-6.
10.4 Результаты гидролиза осиновой древесины ФП ЦБП, ЦБГП и ЭГП
10.5 Результаты гидролиза измельчённой осиновой древесины смесью препаратов ЦБП и ЭГИ
10.6 Результаты гидролиза измельчённой осиновой древесины смесью препаратов ЦБП и ЭГИ
10.7 Сравнение гидролитической способности рекомбинантных ФП с коммерческими
10.8 Состав рекомбинантных ферментных препаратов целлюлаз
Глава 11. Получение ферментных препаратов инулиназ на основе рекомбинантных штаммов P.canescens
11.1. Выделение генов и создание экспрессионных конструкций
11.2. Трансформации штамма-реципиента P. canescens RN3
11.3. Анализ ФП с помощью методов электрофореза и изоэлектрофокусирования
11.4. Активность ферментных препаратов инулиназ по отношению к различным субстратам
11.5. Ферментативный гидролиз чистого инулина и клубней топинамбура ФП, полученными на основе P.canescens

TAQ (Sigma, США), для скрининга грибных колоний со вставкой целевого гена использовали полимеразу высоко-термостабильную Phire Hot Start DNA полимераза (Finnzymes, Финляндия). Выделение, наработка и очистка ДНК проводились с использованием наборов фирмы Qiagen (США).
В качестве калибровочного стандарта при определении концентрации белков в растворе методом Лоури использовали БСА.
При изготовлении пластин (70 х 80 х 0.75 мм) с полиакриламидным гелем (ПААГ) для электрофореза в денатурирующих условиях (ДЦС-ЭФ) с концентрирующим (4%) и разделяющим (12%) гелями, а также для изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в 4% ПААГ (125 х 65 х 0.75 мм) использовали реактивы и наборы производства Reanal (Венгрия), Sigma и Bio-Rad (США). Окраску белка в гелях производили красителем Coomassie-Brilliant Blue R-250 производства Ferak (Германия) в 25% трихлоруксусной кислоте или уксусной кислоте производства Poch (Польша). Перед электрофорезом исследуемые растворы ферментов предварительно обрабатывали 1% додецилсульфатом натрия (ДЦС-Na) и 5% ß-меркаптоэтанолом при 100°С в течение 15 мин.
В качестве стандартов для ДЦС-ЭФ использовали смеси белков #SM0431 (14,4-116 кДа) и #SMÛ441 (19-117 кДа) производства Fermentas, включающие лизоцим (14,4 либо 19,0 кДа), ß-лактоглобулин (18,4 либо 26,0 кДа), REase Bsp98I (25,0 кДа), карбоангидразу (34,0 кДа), лактатдегидрогеназу (35,0 кДа), овальбумин (45,0 либо 48,0 кДа), БСА (66,2 либо 85,0 кДа), ß-галактозидазу (116,0 кДа).
В качестве стандартов для ИЭФ использовали смеси белков IEF Calibration kit (pi 2,5-6.5) производства Pharmacia (Швеция), включающие пепсиноген (pi 2,80), амилоглюкозидазу (pi 3,0), метиловый красный (pi 3,5), глюкозооксидазу (pi 4,5), соевый ингибитор трипсина (pi 4,5), ß-лактоглобулин A (pi 5,20), карбоангидразы В быка (pi 5,85), карбоангидразу В человека (pi 6,55).
В качестве стандартов для построения градуировочного графика для распределительной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) при разделении моно- и олигосахаридов использовали: D-фруктозу, D-ксилозу, D-целлобиозу и i-арабинозу, сахарозу, раффинозу- все производства Merck (Гер мания), D-глюкозу -производства Sigma, D-галактозу производства Реахим (Россия), В качестве подвижной фазы для ВЭЖХ использовали раствор NaOH производства Fluka (ФРГ).
Для приготовления буферных растворов использовали реактивы марок х.ч., ч.д.а. и ос.ч. производства Реахим, Pharmacia и Sigma. Растворы, использовавшиеся в качестве элюентов для хроматографии, фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0.45 мкм производства Millipore (США) и тщательно дегазировали.