Разработка метода получения рекомбинантного соматолиберина и его применение для доставки животным с помощью пробиотических бацилл

• Автор: Белякова, Алла Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 138 с. : ил.

Содержание
1. Введение
2. Обзор литературы Ю
2.1 Соматолиберин и его гомологи в системе пептидных факторов 10 регуляции роста
2.1.1 Эволюция первичной структуры соматолиберина (GHRH)
2.1.2 Открытие гипофизарного аденилатциклаза-активирующего 14 полипептида (РАСАР)
2.1.3 Вторичная структура гипофизарного аденилатциклаза- 16 активирующего полипептида (РАСАР)
2.1.4 Протеолитическая активация гипофизарного аденилатциклаза- 16 активирующего полипептида (РАСАР)
2.1.5 Геномная организация гена РАСАР
2.1.6 Филогенетические аспекты эволюции гипофизарного 22 аденилатциклаза-активирующего полипептида (РАСАР)
2.1.7 Биологическое и фармакологическое действие гипофизарного 24 аденилатциклаза-активирующего полипептида (РАСАР)
2.1.8 Эволюция структуры предшественников GHRH и РАСАР
2.1.9 Эволюционные аспекты распределения нейронов, 31 продуцирующих GHRH и РАСАР, в головном мозге
2.1.10 GHRH и РАСАР как факторы регуляции секреции 33 соматотропина
2.1.11 Заключение по литературному обзору
3. Материалы и методы
3.1 Материалы
3.1.1. Стандартные растворы 3
3.1.2. Ферменты обмена ДНК
3.1.3. Среды для выращивания бактерий 3
3.1.4. Штаммы и векторы
3.2. Методы
3.2.1. Очистка плазмидной ДНК методом щелочного лизиса 3
3.2.2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
3.2.3. Очистка ДНК методом препаративного электрофореза с 40 последующей элюцией из агарозного геля
3.2.4 Денатурирующий электрофорез по Лэммли
3.2.5. Выявление соматолиберина с помощью иммуноблоттинга
3.2.6. Трансформация клеток E. coli
3.2.7. Получение бактериальных препаратов рекомбинантных 43 штаммов E. coli
3.2.8. Химическая трансформация бацилл
3.2.9 Ферментация рекомбинантных штаммов, производных
В. licheniformis В-4161 - продуцентов производных сотматолиберина

3.2.10 Выделение геномной ДНК из клеток В. licheniformis
3.2.11 Генно-инженерное конструирование
3.2.12 Организация эксперимента по биологическому тестированию 50 рекомбинантных пробиотических препаратов на мышах
3.2.13 Организация эксперимента по биологическому тестированию 51 рекомбинантных пробиотических препаратов на поросятах-отъёмышах
4 Результаты исследований
4.1 Оптимизация структуры гена соматолиберина для экспрессии 52 в бактериях. Разработка системы измерения уровня накопления в бактериальных культурах и анаболического эффекта производных соматолиберина in vivo
4.1.1 Биологические испытания на модели мышей опытного образца 54 бактериального препарата рекомбинантного штамма E. coli TG1 и
E. coli C41(DE3), несущего ген соматолиберина
4.1.2 Разработка интегративной генетической системы для экспрессии 58 производных гена соматолиберина свиньи в клетках пробиотического штамма В. licheniformis В-4
4.1.3 Мини-ген Е-пептида - новая генетическая детерминанта 60 устойчивости к эритромицину, не кодирующая фермента
4.1.4 Получение опытного образца бактериального препарата 64 рекомбинантного штамма В. licheniformis В-4161, несущего ген соматолиберина
4.1.5 Биологические испытания на модели мышей опытного образца 64 бактериального препарата рекомбинантного штамма В. licheniformis В-4161, несущего ген соматолиберина
4.1.6 Биологические испытания на модели поросят-отъемышей 65 опытного образца бактериального препарата рекомбинантного
штамма В. licheniformis В-4161, несущего ген соматолиберина
5. Обсуждение результатов. Перспективы
использования пробиотических препаратов на основе спорообразующих бактерий.
5.1 Понятие пробиотиков и виды бактерий, лежащие в их основе
5.2 Таксономия спорообразующих бактерий, используемых для 75 получения пробиотиков
5.3 Морфологические и биохимические особенности спор
5.4 Герминация и образование спор в кишечнике
5.5 Выживание и герминация спор в условиях фагоцитоза
5.6 Взаимодействие Bacillus subtilis с клетками кишечника и 85 иммунной системы
5.7 Коммерческие пробиотические препараты на основе 89 спорообразующих бактерий
5.8 Бактерицидные факторы бацилл
5.9 Исследования эффективности бациллярных пробиотиков на 93 животных

5.10 Влияние бациллярных пробиотиков на иммунитет реципиента
5.11 Использование пробиотиков для лечения и профилактики 96 заболеваний человека
5.12 Механизмы действия пробиотиков
5.13 Проблемы биологической безопасности пробиотиков на основе 99 спорообразующих бактерий
5.13.1 Риски пищевых отравлений, связанные с бациллами
5.13.2 Риски развития инфекций от применения бацилл
5.13.3 Устойчивость к антибиотикам и генетическая модификация 101 штаммов
5.13.4 Неточное указание состава препарата
5.14 Регламентация безопасного использования спорообразующих 102 бактерий при изготовлении пробиотических препаратов
5.15 Пробиотические препараты на основе спорообразующих 107 бактерий в качестве вектора для доставки рекомбинантных белковых продуктов в организм животных
5.16 Специфический иммунный ответ на споры
5.17 Иммунный ответ на рекомбинантные штаммы В. зиЫг7м
5.18 Преспективы практического применения 112 рекомбинантныхпробиотических штаммов В. яиЬИШ, продуцирующих соматолиберин свиньи
6. Выводы
7. Литература

Помимо этого ранее было показано, что у птиц, земноводных и рыб в регуляции активности соматотропных клеток участвуют другие нейропептиды: рилизинг-гормон гонадотропина (Melamed et al., 1995), нейропептид У (Peng et al., 1990), рилизинг-гормон тиреотропина, холецистокинин (Himick et al., 1993), бомбезин (Himick & Peter, 1995) и рилизинг-гормон кортикотропина (Rousseau et al., 1999).
2.1.11 Заключение по литературному обзору
В большой мере начало активых работ по исследованию GHRH и РАСАР связано с открытием структурно родственного им нейропептида секретина (Mutt et al., 1970), родоначальника одноимённого суперсемейства пептидов. Было установлено, что семейство GHRH / РАСАР возникло в результате серии последовательных дупликаций отдельных экзонов и целых генов, во многом паралелльных эволюции других генов-членов суперсемейства секретина. В ходе эволюции позвоночных первичная структура GHRH претерпела существенные модификации, а последовательность РАСАР осталась практически неизменной. У низших позвоночных пептиды GHRH и РАСАР расположены тандемно в составе одного белка-предшественника. У млекопитающих, два данных пептида образуются из различных предшественников, что позволяет предположить прохождение генной дупликации общего предка в переходном периоде между птицами и млекопитающими (Рис. 10). Также можно предположить, что низшие позвоночные имеют два связанных гена GHRH / РАСАР, один из которых на сегодняшний день неохарактеризован. У всех изученных на данный момент позвоночных животных секреция СТГ находится под двойным контролем нейропептидов, способных оказывать ингибирующее или стимулирующее действие. Так, соматостатин является ингибитором секреции СТГ у всех позвоночных, в то время как GHRH и РАСАР оказывают стимулирующий эффект на секрецию СТГ, при этом роль ключевого индуктора высвобождения СТГ из соматотропных клеток гипофиза была радикально изменена в процессе эволюции.
Наряду со структурными исследованиями производных соматолиберина
существенное фундаментальное значение имеет вопрос об их фармакодинамике и
фармакокинетике в организме. Однако, приведенные выше литературные данные
указывают на недостаточность экспериментальных данных по этому вопросу. Обращает
на себя внимание, что практически все физиологические эксперименты по исследованию
механизмов действия GHRH in vivo выполнены с использованием химически
синтезированных пептидов, которые для облегчения мониторинга в некоторых случаях
подвергались радиоактивному мечению. При этом низкие действующие концентрации