Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна

• Автор: Голубев, Игорь Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 246 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Оксидаза D-аминокислот

2.1.1. История открытия, локализация и физиологическая роль

2.1.2. Первичная структура DAAO из различных источников

2.1.3. Трехмерная структура и механизм действия DAAO

2.2. Основные свойства DAAO из различных источников

2.2.1. Каталитические свойства

2.2.2. Температурная стабильность

2.2.3. Механизм термоинактивации
2.3. Применение DAAO в биотехнологии
2.3.1. Аналитическая биотехнология
2.3.2. Тонкий органический синтез
2.3.3. Терапия различных заболеваний
2.3.4. Трансгенные растения
2.4 Белковая инженерия DAAO
2.4.1. Белковая инженерия DAAO из Sus crofa (pkDAAO)
2.4.2. Белковая инженерия DAAO из Homo sapiens (hDAAO)
2.4.3. Белковая инженерия DAAO из дрожжей
Rhodotorula gracilis (RgDAAO)
2.4.4. Белковая инженерия DAAO из дрожжей
Trigonopsis variabilis (TvDAAO)
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.2. Методы исследования

3.2.1. Рациональный белковый дизайн
3.2.2. Направленный мутагенез гена tvdaoo
3.2.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле
3.2.4. Выделение ДНК из агарозного геля
3.2.5. Рестрикция ДНК
3.2.6. Лигирование фрагментов ДНК
3.2.7. Трансформация клеток E.coli
3.2.8. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli
3.2.9. Секвенирование ДНК
3.2.10. Экспрессия TvDAAO в клетках E.coli
3.2.11. Выделение и очистка TvDAAO
3.2.12. Белковый электрофорез в денатурирующих условиях
3.2.13. Определение концентрации фермента
3.2.14. Определение активности TvDAAO
3.2.15. Определение каталитических параметров TvDAAO
3.2.16. Изучение температурной стабильности TvDAAO
3.2.17. Математический аппарат теории диссоциативной термоинактивации
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Роль остатка Metl04 в каталитических свойствах
и стабильности TvDAAO
4.1.1. Анализ трехмерной структуры TvDAAO и компьютерное моделирование
4.1.2. Получение мутантных TvDAAO с заменами в 104 положении
4.1.3. Каталитические свойства мутантных TvDAAO с заменами
в 104 положении
4.1.4. Температурная стабильность мутантных TvDAAO с заменами
в 104 положении
4.1.5. Влияние замен Metl04Glu и Metl04Lys на свойства TvDAAO
4.1.6. Удаление соединительной петли с 99 по 110 остаток
в структуре TvDAAO
4.2. Изучение взаимодействия между остатками в 54, 104 и 258 положениях
4.2.1. Компьютерное моделирование замен в 54, 104 и 258 положениях..
4.2.2. Получение мутантных TvDAAO с двойными заменами
в 54/104 и 104/258 положениях
4.2.3. Каталитические свойства мутантных TvDAAO
с двойными заменами
4.2.4. Температурная стабильность мутантных TvDAAO
с двойными заменами
4.3. Оптимизация структуры FAD-связывающего домена TvDAAO
4.3.1. Анализ структуры FAD-связывающего домена TvDAAO.
Компьютерное моделирование
4.3.2. Получение мутантных TvDAAO с заменами
в 9, 12, 32 и 33 положениях
4.3.3. Температурная стабильность мутантных TvDAAO с заменами в кофермент-связывающем домене
4.3.4. Изучение влияния замены E32R/F33D на связывание FAD
4.3.5. Каталитические свойства мутантных TvDAAO с заменами
в кофермент-связывающем домене
4.4. Объединение точечных аминокислотных замен
для получения TvDAAO с улучшенными свойствами
4.4.1. Выбор точечных аминокислотных замен для объединения
4.4.2. Получение мутантных TvDAAO с многоточечными заменами
4.4.3. Каталитические свойства многоточечных мутантных TvDAAO
4.4.4. Температурная стабильность многоточечных мутантных TvDAAO
V. ВЫВОДЫ
VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

2.3. Применение БААО в биотехнологии
Возможность применения Б АЛО в различных областях биотехнологии и органического синтеза дало мощный толчок к поиску, клонированию и изучению новых ферментом начиная с 1970-80 гг. С точки зрения биотехнологического применения наиболее перспективными оказались К^БААО и ТуБААО. В первую очередь это было обусловлено изначально высокой активностью природных ферментов с природным антибиотиком цефалоспорином С. Кроме того, как было отмечено выше, ТуБААО на данный момент является наиболее стабильным ферментом среди изученных БААО.
2.3.1. Аналитическая биотехнология
Качественное и количественное определение Б-аминокислот в биологических образцах имеет большое значение для медицины, химической и пищевой промышленности. Например, Б-аминокислоты входят в состав пептидогликана клеточной стенки бактерий, их присутствие в пище может говорить о ее бактериальном заражении [80]. Также в ходе производства и хранения пищевых продуктов, природные Ь-аминокислоты могут превращаться в Б-изомеры. В продуктах питания, как правило, содержатся такие Б-аминокислоты, как Б-А1а, Б-Бег, Б-Ьеи, Б-РЬе, Б-Рго, Б-С1и, Б-Абр, Б-Ьуя и Б-Аг§. Б-аминокислоты содержатся в хлебе, кофе, овощах и фруктах, шоколаде, вине, молочных продуктах. Например, твердые сыры сортов Огапа Рабапо и Рагтш£1апо Reggiano можно отличить друг от друга по содержанию Б-А1а, Б-01и и Б-Аэр [26]. Концентрация Б-аминокислог может служить для оценки питательной ценности пищи, поскольку степень рацемизации аминокислот зависит от качества и способа получения продуктов [81]. Таким образом, в пищевой биотехнологии БААО может быть использована для контроля качества продуктов питания с помощью количественного определения как Б-аминокислот, так и отношения изомеров Б/(Б+Ь) с использованием ТАЛО.
Количественное определение Б,Б-аминокислот в биологических образцах используется в клинической практике с тех пор, как была установлена связь между